定量pcr引物、探針設計原則(編輯修改稿)
2025-07-26 23:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針。 為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。 Taqman MGB 探針設計探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針水解為單個堿基，與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。 Tm值應為6567℃。 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。 盡量避免出現(xiàn)重復的堿基，尤其是G堿基，應避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復出現(xiàn)。 原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。因此，在進行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。 注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守)，以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp，探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設計簡并探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。 第三步：尋找一家信賴的公司合成引物和探針，一般引物合成大家比較熟悉，而且價格也比較便宜（特別是這兩年便宜了許多），而探針則相對來說貴了許多，一般Taqman探針合成在1000到5000元不等（不同的合成要求價錢不同）——而這只是標記價錢，序列合成基本上和引物合成價錢相似?！〉谒?、五、
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