定量pcr引物、探針設(shè)計(jì)原則-文庫(kù)吧
2025-06-14 23:56 本頁(yè)面
【正文】 易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)，從而會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號(hào)。 為了保證效率和重復(fù)性，應(yīng)避免重復(fù)的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個(gè)連續(xù)的G） 將引物和探針互相進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。 引物設(shè)計(jì)原則序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段 避免引物自身或與引物之間形成4個(gè)或4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu) 典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。 Tm值在55－65℃（因?yàn)?0℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% 引物之間的TM相差避免超過(guò)2℃ 引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上連續(xù)相同的堿基 為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯子。 Taqman探針技術(shù)要求片段長(zhǎng)度在50bp－150bp 引物末端（最后5個(gè)核苷酸）不能有超過(guò)2個(gè)的G和C。 探針設(shè)計(jì)原則探針位置盡可能地靠近上游引物 探針長(zhǎng)度應(yīng)在1545bp（最好是2030bp)，以保證結(jié)合特異性 檢測(cè)探針的DNA折疊和二級(jí)結(jié)構(gòu) Tm值在6570℃，通常比引物TM值高510℃（至少要5℃），GC含量在40%－70% 探針的5’端應(yīng)避免使用G鳥嘌呤——因?yàn)?39。G會(huì)有淬滅作用，而且即使是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用。 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會(huì)降
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