引物篇引物合成及各種問題總結(jié)(編輯修改稿)
2025-04-21 01:47 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務(wù)商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成效率最高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不徹底造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉極少數(shù)539。羥基沒有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復(fù)制和擴(kuò)增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基GA置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)中。？答：引物合成時，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能絕對保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。，該如何處理？答：對您遇到的困惑，我們表示同情。遇到這種情況，首先和我們?nèi)〉寐?lián)系，我們的生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，我們在電腦中保留所有原始數(shù)據(jù)。如果確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯，我們建議重新挑取克隆測序，您可能會找到正確克隆的。根據(jù)我們經(jīng)驗，40個堿基以下的引物，測12個克隆就可以了；40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個克隆突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。您也可以要求我們將引物免費重合一次，不過重合的引物和第一次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?；蚱唇舆^程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。，為什么還有堿基缺失或插入？答：理論上分析型PAGE變性電泳，可以區(qū)分引物之間一個堿基的差別。但是制備PAGE電泳，上樣量都是非常大，電泳時的條帶非常寬，帶與帶之間有重疊，分辨率已下降，電泳后割帶回收目的引物時，很難說不割到差別僅幾個堿基的引物。國內(nèi)有一個不好的現(xiàn)象，PAGE純化的引物，特別是長引物要的量都比較高，導(dǎo)致割的條帶有時可能比較寬。建議：您如果減少OD數(shù)，引物遇到的問題可能就會少一些。19. TaqMan 探針設(shè)計的基本原則是什么？答：下列原則供您參考?！鬞aqMan 探針位置盡可能靠近擴(kuò)增引物（擴(kuò)增產(chǎn)物50150bp），但不能與引物重疊?！糸L度一般為1840mer ?！鬐C含量控制在4080%左右?！舯苊膺B續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)?！粼谝锏?’端避免使用G?！暨x用比較多的堿基C。◆退火溫度Tm控制在 6870C左右。有用的熒光染料參數(shù)Name Name 吸收波長 發(fā)射波長 colors6FAM 6carboxyfluorescein 494nm 518nm GreenTET 5tetrachlorofluorescein 521nm 538nm OrangeHEX 5hexachlorofluorescein 535nm 553nm PinkTAMRA tetramethyl6carboxyrhodamine 560nm 582nm RoseROX 6carboxyxrhodamine 587nm 607nm RedCy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm RedCy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet？答：引物設(shè)計的下列原則供您參考?！粢镩L度一般在1835mer?！鬐C含量控制在4060%左右?！舯苊饨?’端有酶切位點或發(fā)夾結(jié)構(gòu)?！羧绻赡鼙苊庠?’端最后5個堿基有2個以上的G或C?！羧绻赡鼙苊庠?’端最后1個堿基為A?！舯苊膺B續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免
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