【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論 mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析差異表達(dá)的相對(duì)定量分析（（ 1）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法 所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法就是對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對(duì)定所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法就是對(duì)每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對(duì)定量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對(duì)數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)量，求出每個(gè)樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對(duì)數(shù)量，然后根據(jù)相對(duì)定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。定量的基本公式來(lái)求出目的基因的差異表達(dá)。 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法的特點(diǎn)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法的特點(diǎn) ：： （（ a）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)校正擴(kuò)增效）、考慮到了不同基因擴(kuò)增效率的差異，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)校正擴(kuò)增效 率，最大限度的避免了誤差；率，最大限度的避免了誤差； （（ b）、思路直觀(guān)、條理清晰、應(yīng)用簡(jiǎn)便，操作靈活，無(wú)需像）、思路直觀(guān)、條理清晰、應(yīng)用簡(jiǎn)便，操作靈活，無(wú)需像 Delta delta CT法那樣對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化；法那樣對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行反復(fù)的優(yōu)化； （（ c）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲）、其不足之處是每次實(shí)驗(yàn)都必需對(duì)目的基因和看家基因做標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)；線(xiàn)； （（ d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實(shí)驗(yàn)。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論技術(shù)的基礎(chǔ)理論 mRNA差異表達(dá)的相對(duì)定量分析差異表達(dá)的相對(duì)定量分析（（ 2）、）、 2 △△△△ CT法法 該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為 1，在試驗(yàn)開(kāi)始前必須分別對(duì)目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于 ，就可以用該方法分析。而且在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，無(wú)需再做標(biāo)準(zhǔn)品。 該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)?CT值的差異只要有很小的變化，測(cè)得的結(jié)果就會(huì)有很大的差別。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測(cè)的基因種類(lèi)很多的情況。 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì)染料法引物的設(shè)計(jì)原則、染料法引物的設(shè)計(jì)原則 ：：（（ 1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（（ 2）、避免引物自身或與引物之間形成）、避免引物自身或與引物之間形成 4個(gè)或個(gè)或 4個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物個(gè)以上連續(xù)配對(duì)，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（（ 3）、檢測(cè)）、檢測(cè) mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯 子；子；（（ 4）、引物之間的）、引物之間的 TM相差避免超過(guò)相差避免超過(guò) 2℃℃ ；；（（ 5）、典型的引物）、典型的引物 18到到 24個(gè)核苷長(zhǎng)；個(gè)核苷長(zhǎng)；（（ 6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的）、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度盡量一致，不大于產(chǎn)物長(zhǎng)度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因，這樣有利于使兩種基因 PCR效率相同效率相同（（ 7）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做 BLAST分析其分析其 特異性特異性 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì) Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則 ：： 在在 Taqman探針?lè)ㄖ?，探針?lè)ㄖ校?Taq酶除了酶除了 5’3’聚合酶作用之外，還要聚合酶作用之外，還要 5’3’外切酶外切酶的活性來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通的活性來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通 PCR的延伸溫度為的延伸溫度為 72℃℃ ，此溫度為，此溫度為 Taq酶聚合作用的最佳溫度；酶聚合作用的最佳溫度； Taqman探針?lè)ǚ磻?yīng)中，在要求探針?lè)ǚ磻?yīng)中，在要求 Taq酶酶 5’3’聚合酶聚合酶活活性的同時(shí)，還需要性的同時(shí)，還需要 Taq酶酶 5’3’外切酶的活性來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，外切酶的活性來(lái)切斷探針鏈產(chǎn)生熒光， Taq酶酶5’3’外切酶活性的最佳溫度為外切酶活性的最佳溫度為 60℃℃ ，所以，所以 Taqman PCR反應(yīng)的一般采用兩步反應(yīng)的一般采用兩步法，即法，即 95℃℃ 變性，變性， 60℃℃ 復(fù)性延伸。復(fù)性延伸。 在在 Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)過(guò)程中，引物的探針及引物的設(shè)計(jì)過(guò)程中，引物的 TM值已經(jīng)確定為值已經(jīng)確定為 60℃℃ 左左右，在每輪右，在每輪 PCR循環(huán)的復(fù)性過(guò)程中（循環(huán)的復(fù)性過(guò)程中（ 95→→ 60℃℃ ），為了確保探針先于引物），為了確保探針先于引物與與模板結(jié)合，這就要求探針的模板結(jié)合，這就要求探針的 TM值高于引物值高于引物 10℃℃ 左右，所以左右，所以 Taqman探針及探針及引引物一般都是引物物一般都是引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右。左右。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì) Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則 ：：（（ 1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（（ 2）、檢測(cè)）、檢測(cè) mRNA時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯時(shí)，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個(gè)外顯 子；子；（（ 3）、引物）、引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右；左右；（（ 4）、探針的）、探針的 5’端應(yīng)避免使用鳥(niǎo)嘌呤端應(yīng)避免使用鳥(niǎo)嘌呤 G，因?yàn)?，因?yàn)?5’G會(huì)有淬滅作用，而且即使會(huì)有淬滅作用，而且即使 是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用；是被切割下來(lái)還會(huì)存在淬滅作用； （（ 5）、整條探針中，堿基）、整條探針中，堿基 C的含量要明顯高于的含量要明顯高于 G的含量的含量 G含量高會(huì)降低反應(yīng)含量高會(huì)降低反應(yīng) 效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針；效率，這時(shí)就應(yīng)選擇配對(duì)的另一條鏈作為探針； （（ 6）、引物之間的）、引物之間的 TM相差避免超過(guò)相差避免超過(guò) 2℃℃ ；；（（ 7）、典型的引物長(zhǎng)度為）、典型的引物長(zhǎng)度為 1824bp，探針長(zhǎng)度為，探針長(zhǎng)度為 1545bp；；（（ 8）、）、 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在產(chǎn)物長(zhǎng)度在 50150bp之間，這樣有利于使之間，這樣有利于使 PCR效率相同；效率相同；（（ 9）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做）、將設(shè)計(jì)好的引物用序列分析軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)并做 BLAST分析其分析其 特異性特異性 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì) Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)原則探針及引物的設(shè)計(jì)原則 ：：探針中 GC含量的差異對(duì)定量 PCR反應(yīng)效率的影響二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì) Taqman探針及引物的設(shè)計(jì)舉例探針及引物的設(shè)計(jì)舉例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC經(jīng)經(jīng) Oligo軟件驗(yàn)證，探針軟件驗(yàn)證，探針 TM值值 70℃℃ 左右，左右， 上下游引物的上下游引物的 TM值都為值都為 60 ℃℃ 左右，二級(jí)結(jié)構(gòu)左右，二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，引物和探針比較理想，再經(jīng)分析，引物和探針比較理想，再經(jīng) BLAST分析，引物和探針特異性較好。分析，引物和探針特異性較好。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì) Taqman探針及引物合成時(shí)注意事項(xiàng)探針及引物合成時(shí)注意事項(xiàng)（（ 1）、引物及探針設(shè)計(jì)好之后，委托一家放心的合成公司合成；）、引物及探針設(shè)計(jì)好之后，委托一家放心的合成公司合成；（（ 2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè) PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度吻合，再看看非特異產(chǎn)物，看是否和設(shè)計(jì)的長(zhǎng)度吻合，再看看非特異 性擴(kuò)增情況，必要時(shí)進(jìn)行性擴(kuò)增情況，必要時(shí)進(jìn)行 PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證；產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證；（（ 3）、確定引物沒(méi)有問(wèn)題后，再將探針?biāo)徒缓铣?，這樣安排能避免很多以）、確定引物沒(méi)有問(wèn)題后，再將探針?biāo)徒缓铣桑@樣安排能避免很多以 外的損失；外的損失；（（ 4）、探針合成好后，先檢測(cè)一下探針的質(zhì)量，）、探針合成