【文章內容簡介】 、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論 mRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析（（ 1）、雙標準曲線法）、雙標準曲線法 所謂的雙標準曲線法就是對每個樣品的內參基因和目的基因都做絕對定所謂的雙標準曲線法就是對每個樣品的內參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。 雙標準曲線法的特點雙標準曲線法的特點 ：： （（ a）、考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效）、考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效 率，最大限度的避免了誤差；率，最大限度的避免了誤差； （（ b）、思路直觀、條理清晰、應用簡便，操作靈活，無需像）、思路直觀、條理清晰、應用簡便，操作靈活，無需像 Delta delta CT法那樣對實驗進行反復的優(yōu)化；法那樣對實驗進行反復的優(yōu)化； （（ c）、其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做標準曲）、其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做標準曲 線；線； （（ d）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。）、該方法適合樣品量大，但是所分析目的基因較少的實驗。一、熒光定量一、熒光定量 PCR技術的基礎理論技術的基礎理論 mRNA差異表達的相對定量分析差異表達的相對定量分析（（ 2）、）、 2 △△△△ CT法法 該方法的前提條件是目的基因和內參基因的擴增效率相同且都為 1，在試驗開始前必須分別對目的基因和內參基因作標準曲線，看兩者擴增效率的差別，假如兩者擴增效率之間的差異小于 ，就可以用該方法分析。而且在接下來的實驗中，無需再做標準品。 該方法要求嚴格的重復，因為 CT值的差異只要有很小的變化，測得的結果就會有很大的差別。 該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計染料法引物的設計原則、染料法引物的設計原則 ：：（（ 1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（（ 2）、避免引物自身或與引物之間形成）、避免引物自身或與引物之間形成 4個或個或 4個以上連續(xù)配對，避免引物個以上連續(xù)配對，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；（（ 3）、檢測）、檢測 mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯 子；子；（（ 4）、引物之間的）、引物之間的 TM相差避免超過相差避免超過 2℃℃ ；；（（ 5）、典型的引物）、典型的引物 18到到 24個核苷長；個核苷長；（（ 6）、目的基因和內參基因所擴增的）、目的基因和內參基因所擴增的 PCR產物長度盡量一致，不大于產物長度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因，這樣有利于使兩種基因 PCR效率相同效率相同（（ 7）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做 BLAST分析其分析其 特異性特異性 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計 Taqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則 ：： 在在 Taqman探針法中，探針法中， Taq酶除了酶除了 5’3’聚合酶作用之外，還要聚合酶作用之外，還要 5’3’外切酶外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光，普通的活性來切斷探針鏈產生熒光，普通 PCR的延伸溫度為的延伸溫度為 72℃℃ ，此溫度為，此溫度為 Taq酶聚合作用的最佳溫度；酶聚合作用的最佳溫度； Taqman探針法反應中，在要求探針法反應中，在要求 Taq酶酶 5’3’聚合酶聚合酶活活性的同時，還需要性的同時，還需要 Taq酶酶 5’3’外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光，外切酶的活性來切斷探針鏈產生熒光， Taq酶酶5’3’外切酶活性的最佳溫度為外切酶活性的最佳溫度為 60℃℃ ，所以，所以 Taqman PCR反應的一般采用兩步反應的一般采用兩步法，即法，即 95℃℃ 變性，變性， 60℃℃ 復性延伸。復性延伸。 在在 Taqman探針及引物的設計過程中，引物的探針及引物的設計過程中，引物的 TM值已經確定為值已經確定為 60℃℃ 左左右，在每輪右，在每輪 PCR循環(huán)的復性過程中（循環(huán)的復性過程中（ 95→→ 60℃℃ ），為了確保探針先于引物），為了確保探針先于引物與與模板結合，這就要求探針的模板結合，這就要求探針的 TM值高于引物值高于引物 10℃℃ 左右，所以左右，所以 Taqman探針及探針及引引物一般都是引物物一般都是引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右。左右。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計 Taqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則 ：：（（ 1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（（ 2）、檢測）、檢測 mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯 子；子；（（ 3）、引物）、引物 TM值為值為 60℃℃ 左右，探針的左右，探針的 TM值為值為 70℃℃ 左右；左右；（（ 4）、探針的）、探針的 5’端應避免使用鳥嘌呤端應避免使用鳥嘌呤 G，因為，因為 5’G會有淬滅作用，而且即使會有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用；是被切割下來還會存在淬滅作用； （（ 5）、整條探針中，堿基）、整條探針中，堿基 C的含量要明顯高于的含量要明顯高于 G的含量的含量 G含量高會降低反應含量高會降低反應 效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針；效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針； （（ 6）、引物之間的）、引物之間的 TM相差避免超過相差避免超過 2℃℃ ；；（（ 7）、典型的引物長度為）、典型的引物長度為 1824bp，探針長度為，探針長度為 1545bp；；（（ 8）、）、 PCR產物長度在產物長度在 50150bp之間，這樣有利于使之間，這樣有利于使 PCR效率相同；效率相同；（（ 9）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做 BLAST分析其分析其 特異性特異性 二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計 Taqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則 ：：探針中 GC含量的差異對定量 PCR反應效率的影響二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計 Taqman探針及引物的設計舉例探針及引物的設計舉例 1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA241 GGAGACAATG GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC CACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC經經 Oligo軟件驗證，探針軟件驗證，探針 TM值值 70℃℃ 左右，左右， 上下游引物的上下游引物的 TM值都為值都為 60 ℃℃ 左右，二級結構左右，二級結構分析，引物和探針比較理想，再經分析，引物和探針比較理想，再經 BLAST分析，引物和探針特異性較好。分析，引物和探針特異性較好。二、引物及二、引物及 Taqman探針的設計探針的設計 Taqman探針及引物合成時注意事項探針及引物合成時注意事項（（ 1）、引物及探針設計好之后，委托一家放心的合成公司合成；）、引物及探針設計好之后，委托一家放心的合成公司合成；（（ 2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測，電泳檢測 PCR產物，看是否和設計的長度吻合，再看看非特異產物，看是否和設計的長度吻合，再看看非特異 性擴增情況，必要時進行性擴增情況，必要時進行 PCR產物的測序驗證；產物的測序驗證；（（ 3）、確定引物沒有問題后，再將探針送交合成，這樣安排能避免很多以）、確定引物沒有問題后，再將探針送交合成，這樣安排能避免很多以 外的損失；外的損失；（（ 4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質量，）、探針合成