pcr引物設(shè)計(jì)黃金原則(編輯修改稿)
2025-02-12 05:18 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 量使其△G值不要過高（）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 8. 引物5′ 端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3′ 端△G值較低。 △G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析）′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。 10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。 某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，
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