幾種pcr擴增的比較(編輯修改稿)
2025-07-20 16:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 也使得PCR技術的操作簡便易行。但是，PCR技術是在液相中進行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結果與組織細胞的形態(tài)結構聯(lián)系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。 原位PCR技術成功地將PCR技術和原位雜交技術結合起來，保持了兩項技術的優(yōu)勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢標本一般先經(jīng)化學固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內(nèi)或細胞核內(nèi)，以固定在細胞內(nèi)或細胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進行擴增。擴增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴增，擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術檢查。 2基本類型根據(jù)在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記，原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉錄原位PCR技術等。 直接法原位PCR技術是將擴增的產(chǎn)物直接攜帶標記分子，即使用標記的三磷酸腺苷或引物片斷。當標本進行PCR擴增時，標記的分子就摻入到擴增的產(chǎn)物中，顯示標記物，就能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現(xiàn)出來。常用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示標記物所在位置。直接法原位PCR技術的優(yōu)點是操作簡便，流程短，省時。缺點是特異性較差，易出現(xiàn)假陽性，擴增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點更為突出。因為在制片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會導致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應體系中的標記三磷酸核苷進行修復，這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。若用標記引物的方法進行直接法原位PCR，其擴增的效率比不標記更低。 間接法原位PCR技術師現(xiàn)在細胞內(nèi)進行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。間接法原位PCR與直接法不同的是，反應體系與常規(guī)PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現(xiàn)先擴增的目的，然后用原位雜交技術去檢測細胞內(nèi)已擴增的特定的DNA產(chǎn)物，因此，實際上是將PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術的優(yōu)點是特異性較高，擴增效率也較高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。 原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RTPCR)是將液相的RTPC技術應用到組織細胞標本中的一種新技術，與RTPCR（液相）不同點在于，進行原位反轉錄PCR反應之前，組織標本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RTPCR相似。 3基本步驟原位PCR技術的基本步驟包括標本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述如下（重點以石蠟切片為例）。 原位PCR技術可應用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標本經(jīng)制片后，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導致擴增的產(chǎn)物在原位不易保留。絕大多數(shù)的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題，意義顯然是十分重大的。 組織細胞的固定:一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長，視組織的大小，一般以4℃46小時為宜。 切片的厚度:一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜結構也較多，防止擴增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形態(tài)學觀察的效果就差了，分辨率也將下降。 玻片的處理:為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應作防脫片處理，常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。 蛋白酶的消化作用:在進行原位擴增之前，組織標本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進入細胞內(nèi)，并能很好的暴露靶序列，以利于擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據(jù)組織固定的程度進行調(diào)整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨后進行的PCR反應體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利于后續(xù)進行的各反應成分進入細胞內(nèi)或核內(nèi)，但同時也使得擴增產(chǎn)物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結果。 原位擴增（PCR） 原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應，其基本原理與液相PCR完全相同。 引物:PCR所用的引物一般為1530bp為宜，擴增的片斷為1001000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石
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