幾種pcr擴(kuò)增的比較(編輯修改稿)
2025-07-20 16:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 也使得PCR技術(shù)的操作簡(jiǎn)便易行。但是，PCR技術(shù)是在液相中進(jìn)行的，在擴(kuò)增前，需將細(xì)胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結(jié)果與組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)，同時(shí)，也很難判斷含特異性靶序列的細(xì)胞類型。 原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，保持了兩項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)又彌補(bǔ)了各自的不足。原位PCR技術(shù)的待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過(guò)細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 2基本類型根據(jù)在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標(biāo)記，原位PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉(zhuǎn)錄原位PCR技術(shù)等。 直接法原位PCR技術(shù)是將擴(kuò)增的產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子，即使用標(biāo)記的三磷酸腺苷或引物片斷。當(dāng)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記的分子就摻入到擴(kuò)增的產(chǎn)物中，顯示標(biāo)記物，就能將特定的DNA或RNA在標(biāo)本（原位）中顯現(xiàn)出來(lái)。常用的標(biāo)記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標(biāo)記物所在位置。直接法原位PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，流程短，省時(shí)。缺點(diǎn)是特異性較差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，擴(kuò)增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點(diǎn)更為突出。因?yàn)樵谥破^(guò)程中，無(wú)論是固定，脫水還是包埋，都會(huì)導(dǎo)致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應(yīng)體系中的標(biāo)記三磷酸核苷進(jìn)行修復(fù)，這樣標(biāo)記物就會(huì)摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽(yáng)性。若用標(biāo)記引物的方法進(jìn)行直接法原位PCR，其擴(kuò)增的效率比不標(biāo)記更低。 間接法原位PCR技術(shù)師現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特定DNA或RNA擴(kuò)增，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應(yīng)用最為廣泛的原位PCR技術(shù)。間接法原位PCR與直接法不同的是，反應(yīng)體系與常規(guī)PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標(biāo)記物。即實(shí)現(xiàn)先擴(kuò)增的目的，然后用原位雜交技術(shù)去檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)已擴(kuò)增的特定的DNA產(chǎn)物，因此，實(shí)際上是將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種新技術(shù)，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是特異性較高，擴(kuò)增效率也較高。缺點(diǎn)是操作步驟較直接法繁瑣。 原位反轉(zhuǎn)錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RTPCR)是將液相的RTPC技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種新技術(shù)，與RTPCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴(kuò)增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細(xì)胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RTPCR相似。 3基本步驟原位PCR技術(shù)的基本步驟包括標(biāo)本的制備。原位擴(kuò)增（PCR）及原位檢測(cè)等基本環(huán)節(jié)，現(xiàn)分述如下（重點(diǎn)以石蠟切片為例）。 原位PCR技術(shù)可應(yīng)用于細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細(xì)胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術(shù)方面的一些問(wèn)題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報(bào)道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導(dǎo)較差，熱對(duì)流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標(biāo)本經(jīng)制片后，細(xì)胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴(kuò)增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導(dǎo)致擴(kuò)增的產(chǎn)物在原位不易保留。絕大多數(shù)的病理標(biāo)本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關(guān)技術(shù)問(wèn)題，意義顯然是十分重大的。 組織細(xì)胞的固定:一般認(rèn)為組織細(xì)胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進(jìn)行原位PCR效果較好。固定的時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)，視組織的大小，一般以4℃46小時(shí)為宜。 切片的厚度:一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因?yàn)榍衅胶?，靶DNA的含量也就越多，同時(shí)膜結(jié)構(gòu)也較多，防止擴(kuò)增產(chǎn)物彌散的作用也越明顯。但厚切片細(xì)胞重疊多，形態(tài)學(xué)觀察的效果就差了，分辨率也將下降。 玻片的處理:為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過(guò)程中脫落，在玻片應(yīng)作防脫片處理，常用的方法是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。 蛋白酶的消化作用:在進(jìn)行原位擴(kuò)增之前，組織標(biāo)本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消化的組織細(xì)胞，可增加其通透性，充分允許反應(yīng)體系中的各成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并能很好的暴露靶序列，以利于擴(kuò)增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據(jù)組織固定的程度進(jìn)行調(diào)整。蛋白酶消化后，要注意加熱以滅活酶的活性或通過(guò)充分的洗滌將酶完全去除，因?yàn)橹灰猩倭康臍埩裘复嬖冢紝?duì)隨后進(jìn)行的PCR反應(yīng)體系的數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。蛋白酶消化處理組織細(xì)胞可提高通透性，有利于后續(xù)進(jìn)行的各反應(yīng)成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)，但同時(shí)也使得擴(kuò)增產(chǎn)物的彌散機(jī)會(huì)增多，有可能帶來(lái)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。 原位擴(kuò)增（PCR） 原位擴(kuò)增即在組織細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其基本原理與液相PCR完全相同。 引物:PCR所用的引物一般為1530bp為宜，擴(kuò)增的片斷為1001000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石
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