幾種pcr擴(kuò)增的比較-wenkub
2023-07-08 16:09:14 本頁(yè)面
【正文】 酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性退火延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反應(yīng)速度。 3. PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 10擴(kuò)增緩沖液 10μl 4種dNTP混合物 200μl 引物 10～100μl 模板DNA ～2μg Taq DNA聚合酶 μl Mg2+ 加雙或三蒸水 100 μl PCR反應(yīng)五要素參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。現(xiàn)今所使用的酶(簡(jiǎn)稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermus aquaticus）分離出來(lái)的。普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR的基本原理和操作步驟普通PCR1概述 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。它的特性就在于能耐高溫，是一個(gè)很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。Dr. Mullis 并于1985年與Saiki 等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān)的論文。 2 PCR原理 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。［PCR步驟］標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步： （90℃96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA （25℃65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 4 PCR反應(yīng)特點(diǎn) PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：② 底物與模板DNA特異正確的結(jié)合； ②堿基配對(duì)原則； ③ Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；④ 基因的特異性與保守性。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。Mg2+濃度：Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。②減少dNTP的濃度?？v觀形態(tài)研究領(lǐng)域，50年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀察領(lǐng)域，帶來(lái)了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平的深入研究；6070年代，免疫組織化學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，又將觀察的水平由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)推向了蛋白質(zhì)分子水平，使細(xì)胞內(nèi)眾多的活性物質(zhì)得以進(jìn)行細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，對(duì)醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展無(wú)疑產(chǎn)生了深刻的影響。 PCR技術(shù)是在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)過(guò)模板的變性、退火和引物延伸三種循環(huán)，將引物引導(dǎo)下的特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的靶序列（一般能擴(kuò)增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來(lái)，因此，PCR技術(shù)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，隨著熱循環(huán)自動(dòng)化的提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)的操作簡(jiǎn)便易行。細(xì)胞膜和核膜均具有一定的通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。 直接法原位PCR技術(shù)是將擴(kuò)增的產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子，即使用標(biāo)記的三磷酸腺苷或引物片斷。缺點(diǎn)是特異性較差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性，擴(kuò)增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點(diǎn)更為突出。間接法原位PCR與直接法不同的是，反應(yīng)體系與常規(guī)PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標(biāo)記物。 原位反轉(zhuǎn)錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RTPCR)是將液相的RTPC技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中的一種新技術(shù)，與RTPCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴(kuò)增的模板是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，而不是細(xì)胞
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