幾種pcr擴(kuò)增的比較(參考版)
2025-06-26 16:09本頁面
【正文】 。通常在最后一輪要適當(dāng)?shù)膶⒀由鞎r(shí)間延長至410min，這樣做是使pcr反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量。（當(dāng)然是在反應(yīng)體系一定的條件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度時(shí)的堿基摻入率為35100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。 ：．1模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 2．(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； ：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 使DNA充分變性，減少DNA 復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響，以利于引物更好的和模板結(jié)合，特別是對(duì)于基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個(gè)步驟。real time PCR 與reverse transcription PCR 相結(jié)合，能用微量的RNA來找出特定時(shí)間、細(xì)胞、組織內(nèi)的特別表達(dá)的遺傳基因。 real time PCR 的定量使用螢光色素，目前有二種方法。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQPCR(realtime quantitative PCR)。（檢測(cè)基因表達(dá)的方法，參見Northern Blot法。 RTPCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。在RTPCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄PCR1概念RTPCR 為反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫。將反向 PCR用于測(cè)序時(shí)，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用，它使測(cè)序引物擴(kuò)增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物的干擾。 聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃30秒變性，58℃30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中，為產(chǎn)生對(duì)反向 PCR大小適當(dāng)?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測(cè)雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點(diǎn)。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(diǎn)(例如，互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接)。反向PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定，目前，PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為34kb。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。 該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3’端是相互反向的。 反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識(shí)別十分重要。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。 對(duì)于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝的低表達(dá)固有基因，原位雜交技術(shù)因基因拷貝數(shù)太少而無能為力，液相PCR雖可進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)出來，但不能確定含有該基因的細(xì)胞類型，原位PCR技術(shù)則彌補(bǔ)了上述兩種技術(shù)的不足，使得我們能夠?qū)θ祟惛鞣N基因進(jìn)行檢測(cè)，而完成人類基因圖的繪制。因此，原位PCR技術(shù)成為重要的檢測(cè)手段。 最突出的應(yīng)用是在結(jié)核桿菌的檢測(cè)上，當(dāng)結(jié)核病變不夠典型時(shí)，經(jīng)過特殊染色的方法很難在鏡下找到結(jié)核桿菌，而應(yīng)用原位PCR技術(shù)可幫助明確診斷，當(dāng)結(jié)核桿菌很少時(shí)仍能在鏡下被很容易地找出來。 感染病毒的細(xì)胞常無較好的檢測(cè)手段，但當(dāng)原位PCR技術(shù)應(yīng)用后，使這一極為困難的問題有望解決。 4原位PCR技術(shù)的應(yīng)用 原位PCR技術(shù)的突出優(yōu)勢(shì)，就是能在組織細(xì)胞原位檢測(cè)出拷貝數(shù)較低的特異性基因序列。 原位檢測(cè):原位PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法，取決于原位PCR的設(shè)計(jì)方案，直接法則根據(jù)標(biāo)記分子的性質(zhì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測(cè)。但是，洗滌過度，也會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增的產(chǎn)物被洗脫，是陽性信號(hào)減弱或丟失。 洗滌:原位擴(kuò)增結(jié)束后，標(biāo)本應(yīng)清洗，以除去彌散到細(xì)胞外的擴(kuò)增產(chǎn)物。為了保證進(jìn)行充分的擴(kuò)增，原位PCR熱循環(huán)中每一步驟的時(shí)間可比常規(guī)PCR略長些，另外，也可采用熱啟動(dòng)（hot start）的方法，即玻片加熱到8094℃時(shí)，再立即加入TaqDNA聚合酶
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