幾種pcr擴(kuò)增的比較-資料下載頁
2025-06-23 16:09本頁面
【正文】 用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。 用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定，目前，PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為34kb。在許多情況下，首先 需要進(jìn)行Southern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(diǎn)(例如，互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接)。對(duì)于擴(kuò)增左翼或右翼序列，初試時(shí) 最好靠近識(shí)別上個(gè)堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測(cè)雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點(diǎn)。 用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中，為產(chǎn)生對(duì)反向 PCR大小適當(dāng)?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切 酶失活。 聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃30秒變性，58℃30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測(cè)序時(shí)，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用，它使測(cè)序引物擴(kuò)增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物的干擾。 描述一種大聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知 成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的，以產(chǎn)生適合于擴(kuò) 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子的引物同源于環(huán)上核心區(qū) 的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)這種反向方法可用于擴(kuò)增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列 探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身的上下游序列。逆轉(zhuǎn)錄PCR1概念RTPCR 為反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptionPCR, RTPCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RTPCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。 由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補(bǔ)DNA。 RTPCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNA。RTPCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。（檢測(cè)基因表達(dá)的方法，參見Northern Blot法。） RTPCR有時(shí)候也會(huì)指代實(shí)時(shí)PCR(realtime PCR)。為了與逆轉(zhuǎn)錄PCR相區(qū)別，通常被寫作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQPCR(realtime quantitative PCR)。 時(shí)實(shí)PCR，屬于定量PCR（QPCR）的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。 real time PCR 的定量使用螢光色素，目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的螢光色素；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結(jié)合的一種螢光探針（probe）。real time PCR 與reverse transcription PCR 相結(jié)合，能用微量的RNA來找出特定時(shí)間、細(xì)胞、組織內(nèi)的特別表達(dá)的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為“定量RTPCR（quantitative RTPCR）” PCR各步驟的目的：破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 使DNA充分變性，減少DNA 復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響，以利于引物更好的和模板結(jié)合，特別是對(duì)于基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個(gè)步驟。此外，在一些使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應(yīng)中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應(yīng)得以順利進(jìn)行。 ：．1模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 2．(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； ：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 3用PCR儀擴(kuò)增時(shí),(,延伸)循環(huán)完成后,繼續(xù)72度延伸了10分鐘的原因： 。（當(dāng)然是在反應(yīng)體系一定的條件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度時(shí)的堿基摻入率為35100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。 ，擴(kuò)增1kb以內(nèi)的dna片段1min即可，而34kb則需要34min，依次照推。通常在最后一輪要適當(dāng)?shù)膶⒀由鞎r(shí)間延長至410min，這樣做是使pcr反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量。 ，還有一個(gè)作用是：在用普通taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。
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