pcr引物設(shè)計黃金原則(已修改)
2025-01-28 05:18 本頁面
【正文】 。 DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。 ~30堿基之間。 引物長度（primer length）常用的是1827 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。 %~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（position）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。 ′端要避開密碼子的第3位。 如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。 ′端不能選擇
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