【正文】 第一篇：pcr檢測技術(shù)《食品安全學》綜述PCR快速檢測技術(shù)綜述1．前言聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾個星期才能做到的事情，用PCR幾個小時便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學領(lǐng)域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。該酶促反應(yīng)最基本的3個環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來，定性技術(shù)不斷改進和完善，可以達到檢測單個靶序列的水平、但實際工作中常需要定量檢測標本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對基因快速、敏感、特異而準確定量成為目前分子生物學技術(shù)研究的熱點之一。定量PCR旨在評估樣品中靶分子數(shù)，此測定可以是絕對的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個，即對PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴增、競爭性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對其選擇取決于靶基因的特性、對PCR產(chǎn)量的期望值、對準確度的要求、需要相對還是絕對定量。人類對于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想。但是，當時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實際意義。1985年，美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學界的普遍認同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。但是，最初的PCR技術(shù)相當不成熟，在當時是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實驗室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進，提高了擴增的真實性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。目前從事分子生物學的實驗室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個分子生物學家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學實驗室的常規(guī)方法，可用于達到以下目的：[1] 擴增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；[3]基因功能和表達調(diào)控的研究； [4]基因組測序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；[2][1]在遺傳學上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因為某一堿基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識別位點，通過PCR結(jié)合限制片段長度多態(tài)性分析（PCRRFLP），就可以從基因的水平對遺傳性疾病進行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個新的PstI酶切點，因此可以使用PCRRFLP對血友病進行診斷。PCR還可以用來檢測遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對不同腫瘤尋找其特異而敏感的標志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測微小殘留病灶，以進一步改進治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個細胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細胞PCR技術(shù)對癌癥的發(fā)病機理進行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當進行器官移植時并須先組織配型工作，此時常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCRsequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCRSSOP）對人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR限制性片段長度多態(tài)性也可以用于對HLA的分型。3．[3]例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長度多態(tài)性結(jié)合PCRRFLP來進行法醫(yī)學個體識別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對其進行分析。使用PCR技術(shù)進行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點是樣品用量小并且適于對高度降解材料的檢測。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VNTR）PCR也可以用于法醫(yī)學個體識別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCRRFLP、PCRSSOP、VNTR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個體識別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學的各個領(lǐng)域。21世紀是生物工程的世紀。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會不斷地得到擴充和完善， DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 標準的PCR過程分為三步：（90℃96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA （25℃65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。（70℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度 醫(yī)學檢驗大致可分為形態(tài)學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱