熒光定量pcr(已修改)
2025-08-13 14:01 本頁面
【正文】 熒光定量 PCR 2022801188 劉 兵 目錄 一、背景知識 二、熒光定量 PCR概述 三、熒光定量 PCR的主要原理 四、熒光定量 PCR定量的理論依據(jù) 五、熒光定量 PCR定量的理論模式 六、熒光定量 PCR的分類 七、傳統(tǒng)的定量 PCR的難點 八、熒光定量 PCR的優(yōu)點 九、怎樣設(shè)計熒光定量 PCR實驗方案 十、熒光定量 PCR技術(shù)在科研中的應(yīng)用 一、背景知識 1985 年，美國 PerkinElmer Cetus 公司人類遺傳研究室 Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)（ Polymerase chain reaction, PCR），使人們夢寐以求的體外無限擴增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實。 （陳旭等， 2022） 1992 年， Higuchi最早提出了實時 PCR 的設(shè)想，它的基本思想是利用熒光染料 EB（溴化乙錠）可以插入到雙鏈核酸中受激發(fā)光的性質(zhì)，在 PCR反應(yīng)的退火或延伸時檢測摻入到雙鏈核酸中 EB的含量就能實時監(jiān)控 PCR反應(yīng)的進程，根據(jù) PCR反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，結(jié)合相應(yīng)的算法，通過加入標(biāo)準(zhǔn)品的方法，就可以對待測樣品中的目標(biāo)基因進行準(zhǔn)確定量。 （陳旭等， 2022） 到 1995 年，美國 PE公司研制成功具有革命性意義的熒光定量 PCR技術(shù)，融合了 PCR高靈敏性、 DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點，直接探測 PCR過程中熒光信號的變化，以獲得特定區(qū)段擴增產(chǎn)物定量的結(jié)果，不需要 PCR后處理或電泳檢測，完全閉管操作（整個過程中僅有加入樣品的一次開蓋），一舉克服了常規(guī) PCR技術(shù)的諸多難題。 （陳旭等， 2022） 二、 熒光定量 PCR概述 （ 1）在熒光定量 PCR 反應(yīng)中， 引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。從而得到一條熒光擴增曲線 。 （朱捷等，2022） （ 2）、 熒光擴增曲線包括 3 個階段：基線期，擴增期和平臺期。只有在熒光信號擴增期，PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，所以可以在這個階段進行定量分析 。（朱捷等， 2022） （ 3）、 為了便于對所檢測樣本進行比較，在熒光定量 PCR 反應(yīng)的指數(shù)期，需要設(shè)定一定熒光信號的閾值，一般這個閾值是以 PCR反應(yīng)的前15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本地信號， 熒光閾值的缺省設(shè)置是 3~15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 （朱捷等， 2022） （ 4）、如果檢測到熒光信號超過閾值被認(rèn)為是真正的信號，它可以用于定義樣本的閾值循環(huán)數(shù)（ Cycle Threshold， Ct）。每個模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系。在 PCR 過程中可以連續(xù)不斷地檢測反應(yīng)體系中熒光信號的變化。當(dāng)信號增強到熒光閾值時， Ct 值被記錄下來 。（朱捷等， 2022） 注： Ct值是指樣品管的熒光信號達(dá)到某一固定閾值的 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)。在 PCR循環(huán)過程中 , 即熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。在實際操作中 , 這個時刻也就是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值的時刻 , 可見 Ct值取決于閾值。（趙煥英等，2022） （ 5）、起始拷貝數(shù)越多， Ct 值越小。利用己知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的 Ct 值， 即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 （朱捷等， 2022） 三、熒光定量 PCR的主要原理 熒光共振能量轉(zhuǎn)移，外來的光源激發(fā)供體
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