熒光定量pcr-文庫吧資料
2024-08-14 14:01本頁面
【正文】 （ 2）、分子信標(biāo) 分子信標(biāo) 是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)， 因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。 PCR擴(kuò)增程序通常是： 94℃ ～ 60 ℃ 40 個(gè)循環(huán)。隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5， 外切酶活性將探針切斷，使得熒光基因與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。（趙煥英等， 2022） 熒光標(biāo)記探針 （ 1）、 水解探針模式（ Taqman） TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的 5， 末端，而淬滅劑則在3， 末端。已有文獻(xiàn)報(bào)道在 PCR反應(yīng)體系中加入 LC Green TM I, 使用一對(duì)引物 , 一個(gè)不作標(biāo)記的探針 , 結(jié)合常規(guī)融解曲線或僅使用一對(duì)引物 , PCR 結(jié)束后通過分析融解曲線的形狀和融解溫度 (Tm值 )的大小 , 對(duì)純合子和雜合子以及寡核苷酸序列多態(tài)性 (SNP)進(jìn)行鑒別。這對(duì)科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。 SYBR Green I 的缺點(diǎn)： 由于 SYBR Green I沒有特異性，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光，對(duì) PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽性發(fā)生。 SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為 520nm。其與雙鏈 DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。染料類如SYBR Green I則是利用與雙鏈 DNA 小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。 （ 2） Ct值與起始模板的線性關(guān)系 由于 Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。 熒光定量 PCR使用外標(biāo)定量的原因： A、內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的影響 若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。 （ 2）、 也可直接根據(jù)系列稀釋外標(biāo)在該次實(shí)時(shí)熒光 PCR的結(jié)果來大略分析擴(kuò)增效率的高低，例如系列 10倍稀釋外標(biāo)在 PCR擴(kuò)增時(shí)有 N2=N0En2, N3=(10*N0)En3，在擴(kuò)增到指數(shù)期時(shí)熒光值相同則代表此點(diǎn)的終末拷貝數(shù)相同，即 N2=N3， En2n3=10，取對(duì)數(shù)得到 ⊿ nlgE=1， E=101/⊿n ， E=2， ⊿ n=；E=， ⊿ n=。 （ 3）、設(shè)定 PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，產(chǎn)生一定的熒光（熒光依賴于某一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù) K，大約在 1010左右）高于背景為儀器所識(shí)別，此時(shí)的循環(huán)數(shù)為 CP（ crossing point），也就是 K=T0 （ 1+E） CP，取對(duì)數(shù)得： lgK=lgT0+CP*lg（ 1+E） CP=1/lg（ 1+E） *lgT0+lgK/lg（ 1+E） 由于對(duì)一特定的 PCR而言， E與 K均為常數(shù)，故上式為循環(huán)數(shù) CP對(duì)原始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù) lgT0一次方程，其標(biāo)準(zhǔn)形式 y=kx+b，該直線的斜率為 1/lg（ 1+E），在橫坐標(biāo)上的截距為 lgK/lg（ 1+E），依據(jù)此作 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。 五、熒光定量 PCR定量的理論模 式 （ 1）、 PCR是對(duì)原始待測(cè)模板核酸的一個(gè)擴(kuò)增過程，任何干擾 PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的
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