【正文】 細(xì)胞中。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用TrisHCl緩沖液。引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCRRFLP、PCRSSOP、VNTR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。但是，當(dāng)時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測單個靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。過去幾天幾個星期才能做到的事情，用PCR幾個小時便可完成。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對高度降解材料的檢測。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。（70℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準(zhǔn)確性。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。PCR技術(shù)類型[5]免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)復(fù)合PCR技術(shù)彩色PCR技術(shù)抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)酶標(biāo)PCR技術(shù)二溫式PCR技術(shù)錨定PCR技術(shù)定量PCR技術(shù)毛細(xì)管PCR技術(shù)多重PCR技術(shù)巢式或套式PCR技術(shù) 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測中（1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計了一對引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。此引物設(shè)計可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: HO55: NM。[6]如16srRNA、23srRNA、1623srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時定量PCR檢測IgH基因重排的研究[D]。并且引入一個——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴(kuò)增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。這樣便可對突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。Ct=1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量。外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。食品安全檢測的主要內(nèi)容食品安全檢測的內(nèi)容比較復(fù)雜，涉及面廣泛，主要的檢測內(nèi)容是：食品污染成分、食品營養(yǎng)成分、食品是否具有添加劑以及食品質(zhì)量的總體檢測等等。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在食品檢測中的具體應(yīng)用檢測食品中所含成分。食物中含有的營養(yǎng)成分和主要物質(zhì)都是人們關(guān)心的重點(diǎn)。實(shí)時定量PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用。隨著毒豆芽、瘦肉精、地溝油等各種食品污染問題的產(chǎn)生，人們對食品的質(zhì)量產(chǎn)生了很大的懷疑。⑤模板核酸變性不徹底。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。其對策有:①必要時重新設(shè)計引物。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管,開蓋時、,因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四實(shí)驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見。被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。目前PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要有： 1．VNTR多態(tài)性該方法擴(kuò)增位點(diǎn)靶基因多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)核心序列數(shù)目不同而形成。STR的PCR擴(kuò)增時間短，變性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一個半小時左右完成30個循環(huán)。STR在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)在于：(1)操作方便簡便，通過多位點(diǎn)累計，可以同一認(rèn)定；(2)靈敏度高，復(fù)合擴(kuò)增可以節(jié)約檢材；(3)片段較小，適宜部分降解DNA的擴(kuò)增。該方法簡單，結(jié)果易分析，缺點(diǎn)是在片段長度差異較大時，長片段可能被漏擴(kuò)增，引起錯誤判斷。呵呵 其實(shí) DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，20℃保存。 (一合理分隔實(shí)驗室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。污染的監(jiān)測一個好的實(shí)驗室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。引物設(shè)計不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時,擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度