【文章內(nèi)容簡介】 方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優(yōu)點。參考文獻[1] 葛忠源。熒光定量PCR檢測DPV弱毒免疫鴨消化道和呼吸道大腸桿菌、葡萄球菌、乳酸桿菌及其數(shù)量變化規(guī)律的研究[D]。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。2006年[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光。檢測HIV1載量的熒光實時定量PCR技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J]。中國病毒學(xué)。2001年02期[3] 顧鳴，[J]，2003，13(2):154157 [4] (EHEC)[J]，1999，3:3135 [5] 石嵐。實時定量PCR檢測IgH基因重排的研究[D]。昆明醫(yī)學(xué)院。2004年 [6] 第二篇：熒光PCR檢測原理實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進行定量分析。其特點有：(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量，進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Realtime OPCR可以應(yīng)用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。實時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個PCR進程，在PCR循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號的平均信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個可信的信號，可以用于定義一個樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計算相對方程式。方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關(guān)系數(shù)（R178。＞），這樣才能認(rèn)為實驗的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個方程式計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 ① 基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實時定量PCR檢測，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實驗中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性?；蛲蛔兓趦蓷l探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。① 病原體檢測：由于實時熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。② 藥物療效考核：利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達。結(jié)果證明，實時熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測化療將引起的反應(yīng)。③ 腫瘤基因檢測：腫瘤的本質(zhì)是細胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實時熒光定量PCR方法都可以檢測出來。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。用實時熒光定量PCR方法對免疫組分進行分析是其應(yīng)用的重要方面。所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。檢測方法Ⅰ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產(chǎn)物的單一性）：探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程，提供待檢基因相關(guān)信息； ，支付預(yù)付款（3050%)；（或客戶提供文獻引物委托本公司合成）； 、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；，主要檢測引物的特異性和擴增效率； ：對所有樣品上機檢測； ，形成報告。收費標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)惠包干價：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費用，上機測試費用（3個重復(fù)）；一個內(nèi)參免費（內(nèi)參3個重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。（threshold）的設(shè)定PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認(rèn)）設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 315 每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct=1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下： ：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的539。－339。外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqManMGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡介1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物