動(dòng)物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)doc(編輯修改稿)
2024-08-13 18:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 二聚體。兩個(gè)引物不應(yīng)有4個(gè)以上的堿基連續(xù)相同或互補(bǔ)；⑥ 引物的3’ 末端應(yīng)與目的片段完全相配。這對(duì)于獲得好的擴(kuò)增結(jié)果非常重要。如果能確定一個(gè)保守氨基酸，可將其密碼子的前2個(gè)堿基作為3’ 末端。⑦ 引物的5’末端可不與目的片段互補(bǔ)，可被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物的5’末端修飾包括：加酶切位點(diǎn)，標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點(diǎn)、引入翻譯起始密碼子、啟動(dòng)子序列等。所附加的限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)是不會(huì)在引物以外的DNA上切割的。為了有效地切割限制性酶切位點(diǎn)，在限制性酶識(shí)別序列的5’端常需添加23個(gè)非特異的額外堿基。⑧ 若是設(shè)計(jì)種或株特異性引物，引物與非特異序列的相似性不能超過70%或有連續(xù)8個(gè)以上的互補(bǔ)堿基相同。可用DNAstar、MegAlign軟件比較相似性，用Oligo50來設(shè)計(jì)引物。(2) PCR的基本原理。 在存在DNA模板、引物、dNTP、適當(dāng)緩沖液（Mg2+）的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過模板DNA、引物之間的變性，退火（復(fù)性），延伸三步反應(yīng)為一周期（cycle），循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA片段得以擴(kuò)增。由于每一周期所產(chǎn)生的DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)30個(gè)周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍。在實(shí)際應(yīng)用中，一般多用30～35個(gè)循環(huán)。(3)瓊脂糖電泳的基本原理。 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，于沸水中溶解，45℃開始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)的作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EBDNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。、步驟和操作要領(lǐng)。(1) PCR擴(kuò)增。 先按單倍擴(kuò)增體系中各試劑的量計(jì)算好n倍（除去模板DNA量）擴(kuò)增體系中各試劑相對(duì)應(yīng)的量，然后在適合體積的離心管中依次加入試劑（如n μl 10PCR Buffer、n2 μl dNTP，n4 μl MgCln μl Forward primer、n μl Reverse primer、n μl ddH2O、n μl Ex Taq酶，最后總體積為n24 μl），經(jīng)離心混勻后，分裝至n個(gè)200μl的離心管中（包括陰陽性對(duì)照），在各管中加入模板DNA（如擴(kuò)增體系為25 μl，則加入1 μl模板DNA），混勻后于PCR擴(kuò)增儀中按已設(shè)好的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。如細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1）基因的擴(kuò)增體系為： 試劑 體積（μl） ddH2O 10x PCR Buffer MgCl2 (25 mM) dNTPs ( mM each) 2 Forward primer (100 pmol/ml, JB3) Reverse primer (100 pmol/ml, ) Ex Taq (5 U/ml) 模板 (gDNA) 1____________________________________________________ 總量 25coxI基因的PCR擴(kuò)增條件：94℃變性 5 min94℃變性 30 s 55℃復(fù)性 30 s 30個(gè)循環(huán)72℃延伸 30 s72℃延伸 5 min 擴(kuò)增完畢后，取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃/20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2) 瓊脂糖凝膠電泳。① 制備凝膠：膠濃度視具體情況而定。%瓊脂糖凝膠為例， g瓊脂糖加入至100 ml TBE電泳緩沖液，于微波爐中或經(jīng)高壓熔化均勻，冷卻至50℃左右，加入溴化乙錠（EB）（10 mg/ml, μl EB/100 ml瓊脂糖凝膠液），混勻后倒入已封好的凝膠灌制膠模中，插上樣品梳。待膠凝固后，從膠模上除去封帶，拔出梳子放入電泳槽中，加入足夠量的電泳緩沖液（要求緩沖液液面高出凝膠表面約1 mm）。② 點(diǎn)樣：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3～5 μl，與適量的加樣緩沖液（Loading buffer, LB））混勻(若為6XLB，35 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μl 6X LB)，然后用取液器將樣品加入點(diǎn)樣孔中，
電大資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1