【正文】 ，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)30個(gè)周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點(diǎn)、引入翻譯起始密碼子、啟動(dòng)子序列等。這樣二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物的Tm值是指寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下50%寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度。l預(yù)熱（60～70℃）的超純水或1TE緩沖液，靜置1 min，10000rpm離心20sec。方法如下：① 取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約20小時(shí)的離心管，旋渦震蕩器震蕩混勻，10000rpm離心2min，上清即為蟲體DNA溶液。l的SDS裂解緩沖液，輕輕混勻，再加入20181。用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2次后，再用超純水反復(fù)沖洗2～3次。寄生蟲DNA的抽提方法有多種，不同種類的寄生蟲蟲體都有其最適合的抽提方法，但各種方法的基本原理都一樣，即先用機(jī)械的方法將蟲體組織破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，蟲體組織中的細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，將蟲體基因組DNA釋放到溶液中。 瓊脂糖；TBE緩沖液；UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒；UNIQ10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒；異丙醇（80%）等。(2) TBE緩沖液：，充分溶解于800 ml去離子水中，加10ml mol/L EDTA（），用去離子水定容至1000ml。（二）PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1．材料。g/181。隨著PCR技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆誔CR診斷技術(shù)所涉及實(shí)驗(yàn)的基本原理，全面熟悉PCR診斷技術(shù)的操作過程，其中包括寄生蟲DNA的提取、PCR引物的設(shè)計(jì)、PCR條件的優(yōu)化、對(duì)目的片斷的擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析、PCR產(chǎn)物的純化等等。l）、異丙醇（80%）、雙蒸水、滅菌超純水等。 提純的蟲體DNA。（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1．材料。三、實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)(一) 寄生蟲基因組DNA的提取及純化。在裂解過程中，蟲體細(xì)胞碎片及大部分蛋白質(zhì)會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被DNA裂解液中的SDS包蓋，通過離心沉淀，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來，變性劑也同時(shí)被除去，從而就可從上清中回收蟲體基因組DNA溶液。若蟲體較小，取一整條蟲體經(jīng)如上洗滌處理。l（25181。將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入1ml清洗樹脂（按50～500181。離心管內(nèi)的液體即為DNA溶液。PCR引物應(yīng)保持合理的G+C含量。若引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基達(dá)3個(gè)以上，就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所附加的限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)是不會(huì)在引物以外的DNA上切割的。在實(shí)際應(yīng)用中，一般多用30～35個(gè)循環(huán)。EB可與DNA分子形成EBDNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。待膠凝固后，從膠模上除去封帶，拔出梳子放入電泳槽中，加入足夠量的電泳緩沖液（要求緩沖液液面高出凝膠表面約1 mm）。 為驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的種或株特異性，往往需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物很特異，且引物長度小于60 bp，則兩種方法都可選用，但如果有非特異性條帶或引物長度大于60 bp時(shí)，就必須用切膠純化的方法。l的DNA溶液加入400 181。⑧ ml離心管中，在柱膜中央加30 181。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。⑧ 取5~10 181。l） _________________________________________________ 模板（gDNA） 1同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和空白對(duì)照。3．整個(gè)操作過程中，一定要注意不要交叉污染。5．加樣前需趕走點(diǎn)樣孔中的氣泡，點(diǎn)樣時(shí)吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。4. 切膠回收時(shí)的瓊脂糖凝膠電泳，必須將電泳槽用自來水充分沖洗，其電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會(huì)有其它DNA污染。6．使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒時(shí)，模板DNA的存在不影響下游工作，而對(duì)于質(zhì)粒模板則要特別小心。廢棄膠應(yīng)集中處理，切勿亂丟。操作完畢后，臺(tái)面要用酒精擦拭數(shù)次；鑷子和剪刀經(jīng)清洗后先用酒精消毒，再用紫外燈照射1~2小時(shí)以破壞或降解殘余的DNA，以免污染其它實(shí)驗(yàn)。 反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1min、65℃退火2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃后延伸7 min。（六）動(dòng)物寄生蟲病特異PCR診斷技術(shù)實(shí)例以檢測(cè)雞柔嫩艾美爾球蟲感染為例，選用Fernandez等（2003）報(bào)道的柔嫩艾美爾球蟲種特異的引物(Tn01F：5’CCGCCCAAACCAGGTGTCACG3’。l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。（提高洗脫溫度至5580℃有利于提高DNA的洗脫效率）⑨ 10000 rpm高速離心1 mi