動物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)doc-文庫吧資料
2025-07-23 18:11本頁面
【正文】 面約1 mm）。① 制備凝膠：膠濃度視具體情況而定。如細胞色素c氧化酶第一亞基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1）基因的擴增體系為： 試劑 體積（μl） ddH2O 10x PCR Buffer MgCl2 (25 mM) dNTPs ( mM each) 2 Forward primer (100 pmol/ml, JB3) Reverse primer (100 pmol/ml, ) Ex Taq (5 U/ml) 模板 (gDNA) 1____________________________________________________ 總量 25coxI基因的PCR擴增條件：94℃變性 5 min94℃變性 30 s 55℃復(fù)性 30 s 30個循環(huán)72℃延伸 30 s72℃延伸 5 min 擴增完畢后，取出PCR擴增產(chǎn)物于4℃/20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?1) PCR擴增。EB可與DNA分子形成EBDNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA含量成正比。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，于沸水中溶解，45℃開始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。在實際應(yīng)用中，一般多用30～35個循環(huán)。這種擴增是通過模板DNA、引物之間的變性，退火（復(fù)性），延伸三步反應(yīng)為一周期（cycle），循環(huán)進行，使目的DNA片段得以擴增。(2) PCR的基本原理。⑧ 若是設(shè)計種或株特異性引物，引物與非特異序列的相似性不能超過70%或有連續(xù)8個以上的互補堿基相同。所附加的限制性酶切位點應(yīng)是不會在引物以外的DNA上切割的。引物的5’末端修飾包括：加酶切位點，標記生物素、熒光、同位素、地高辛等。如果能確定一個保守氨基酸，可將其密碼子的前2個堿基作為3’ 末端。兩個引物不應(yīng)有4個以上的堿基連續(xù)相同或互補；⑥ 引物的3’ 末端應(yīng)與目的片段完全相配。若引物自身連續(xù)互補堿基達3個以上，就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。③ 堿基的組成盡量隨機，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’ 末端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C；④ 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補序列，否則引物自身會折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。而對于較長的引物，Tm值的計算較為復(fù)雜。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。PCR引物應(yīng)保持合理的G+C含量。設(shè)計引物時要遵循以下原則：① 長度不能太長，也不能太短，一般在18～25個堿基左右；② G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%為宜。 PCR反應(yīng)成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計。（二）寄生蟲DNA的PCR擴增及瓊脂糖電泳。離心管內(nèi)的液體即為DNA溶液。⑥ 將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上，在柱中央加入30～50181。④ 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml 柱洗溶液（80%的異丙醇），用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過微型柱，以洗滌DNA樹脂樣品。② 取一支5ml的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入1ml清洗樹脂（按50～500181。首先進行蟲體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA CleanUp System使用說明對DNA進行純化?；靹蚝螅庞诤銣嘏囵B(yǎng)箱中，37℃作用12～48 h，其間不時搖動離心管，使蟲體組織裂解充分。l）的蛋白酶K溶液。l（25181。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過的微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎，加入280181。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，2000g離心5min，取上層卵囊加5倍體積的水，3000g離心10min，沉淀再用無菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得純凈的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊20min，2000g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水，3000g離心10min。若蟲體較小，取一整條蟲體經(jīng)如上洗滌處理。若蟲體較大，用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端部分。2．實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)。純化時，
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