【正文】 n，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于20℃?zhèn)溆?。?將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2 ml收集管的UNIQ10柱中，室溫放置2 min，用臺(tái)式離心機(jī)高速（8000 rpm）離心1 min。(1) 切膠純化法(按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ5柱式DNA膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)：① 取40~50 181。在這樣的情況下，往往需要將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，然后經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序。③ 電泳：接通電極，使DNA向陽(yáng)極移動(dòng)，在1～10 V/cm凝膠的電壓下（常用100 V）進(jìn)行電泳。(1) PCR擴(kuò)增。 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，于沸水中溶解，45℃開(kāi)始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。⑧ 若是設(shè)計(jì)種或株特異性引物，引物與非特異序列的相似性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)以上的互補(bǔ)堿基相同。兩個(gè)引物不應(yīng)有4個(gè)以上的堿基連續(xù)相同或互補(bǔ)；⑥ 引物的3’ 末端應(yīng)與目的片段完全相配。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。（二）寄生蟲(chóng)DNA的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳。② 取一支5ml的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。l）的蛋白酶K溶液。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊20min，2000g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水，3000g離心10min。純化時(shí)，DNA溶液與純化試劑盒中的清洗樹(shù)脂混合后，其混合液在通過(guò)微型柱時(shí)DNA會(huì)結(jié)合在柱上，而其它雜質(zhì)會(huì)通過(guò)微型柱排出；再用80%異丙醇進(jìn)行沖洗，去除殘余雜質(zhì)。寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體的各個(gè)部位都可以作為基因組DNA的抽提材料，如果蟲(chóng)體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學(xué)鑒定以驗(yàn)證其種類(lèi)。2．器具。 超凈工作臺(tái)、微型高速臺(tái)式離心機(jī)、微量取液器（2/20/200/1000 181。l 、100 mM TrisHCl（pH ）30 181。 單個(gè)蟲(chóng)體。通過(guò)設(shè)計(jì)種、株特異的引物，此法只擴(kuò)增出種、株特異的PCR產(chǎn)物，具有很高的特異性。l。3．試劑。l）、有機(jī)架、透明膠帶、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手術(shù)刀、保鮮紙等。為了獲得高含量、高純度的DNA，最好使用新鮮材料。(1) 蟲(chóng)體材料的處理(若為新鮮或凍干保存的蟲(chóng)體，則不需要此步驟)。(2) 蟲(chóng)體材料的裂解。(3) 蟲(chóng)體DNA的抽提和純化。⑤ 拔去注射器，10000rpm離心20sec，以除去殘留的異丙醇。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的寡核甘酸片段，使其能有效地與目的片段兩端的序列互補(bǔ)。由于PCR擴(kuò)增的特異性取決于兩條引物與相應(yīng)模板的結(jié)合，因此，反應(yīng)中退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個(gè)Tm值折衷選擇。⑦ 引物的5’末端可不與目的片段互補(bǔ)，可被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。 在存在DNA模板、引物、dNTP、適當(dāng)緩沖液（Mg2+）的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。不同的DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。(2) 瓊脂糖凝膠電泳。如果僅出現(xiàn)預(yù)期分子量大小的條帶而無(wú)非特異性條帶，則說(shuō)明擴(kuò)增的特異性較好。切膠回收的原理就是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，將要回收的目的片段從凝膠上切下來(lái)，然后再通過(guò)DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，以去除DNA樣品中除了目的基因片段外的所有雜質(zhì)。② 于紫外透射儀中鋪上一塊新鮮的保鮮紙，將凝膠放在保鮮紙上（以盡量提高DNA回收的純度），打開(kāi)長(zhǎng)波紫外燈用干凈的手術(shù)刀快速將目的片段從瓊脂糖凝膠上切下來(lái)（盡可能去除多余的瓊脂糖膠）。l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。(2) PCR產(chǎn)物直接純化法（按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ5柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行）：① 取PCR產(chǎn)物40~50 181。⑥ ml離心管中，在柱膜中央加入30 181。 按常規(guī)方法進(jìn)行， PCR管配制反應(yīng)液，總體積為25μL，其中： 試劑 體積（μl） 10x PCR Buffer MgCl2（25 mM） dNTPs（ mM each） 2 Forward primer（Tn01F, 50 pmol/181。陽(yáng)性對(duì)照可見(jiàn)分子量大小約530bp的條帶；臨床樣品如有同樣大小條帶判為陽(yáng)性；陰性對(duì)照不見(jiàn)擴(kuò)增條帶。3．煮好的膠應(yīng)冷卻至50℃左右時(shí)再倒入膠模中，以免膠模變形，并減少漏膠的機(jī)會(huì)。2．切膠回收時(shí)，于紫外透射儀中切膠的時(shí)間應(yīng)盡可能短，以減少凝膠在紫外光照射