動物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)doc(存儲版)
【正文】 CR產(chǎn)物直接用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。切下來的膠塊放入一新鮮、 ml的離心管中，用電子天平稱重并作好記錄。⑥ 重復(fù)步驟“⑤”一次。l，加入3倍體積的Binding buffer，混勻。l Elution Buffer或雙蒸水（pH＞）到UNIQ10柱中，室溫或37℃放置2 min（提高洗脫溫度至5580℃有利于提高DNA的洗脫效率）。l） Reverse primer（Tn01R, 50 pmol/181。 四、實驗注意事項（一）寄生蟲基因組DNA的提取及純化1．操作中所使用的鑷子和剪刀一定要事先滅菌并于超凈工作臺中紫外照射1~ h，以保證沒有污染其它DNA。4．倒膠注意厚度（4~6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。3. 切膠回收時，對于高濃度的膠（~2%），每100 mg凝膠加入700 181。8。每次使用后一定要將瓶蓋擰緊，以保持Wash solution中的乙醇含量。2．用微波爐煮膠時，膠液的量不要超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。 %TBE瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果。1．PCR反應(yīng)。⑤ 倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回收集管中，高速離心（10000 rpm）1 min。l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，瓊脂糖電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。⑤ 取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回收集管中，加入500 181。注意：必須將電泳槽用自來水充分沖洗，電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會有其它DNA污染。PCR產(chǎn)物的純化方法一般有兩種：一種是切膠回收，另一種是PCR產(chǎn)物直接回收。④ 結(jié)果觀察：將電泳好的瓊脂糖膠置于紫外透射儀中，打開紫外燈，若看到橙紅色的核酸條帶，則說明有擴增的PCR產(chǎn)物；根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計該條帶的DNA量；根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對照，通過線性DNA條帶的相對位置可初步估計擴增產(chǎn)物的分子量。如細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1）基因的擴增體系為： 試劑 體積（μl） ddH2O 10x PCR Buffer MgCl2 (25 mM) dNTPs ( mM each) 2 Forward primer (100 pmol/ml, JB3) Reverse primer (100 pmol/ml, ) Ex Taq (5 U/ml) 模板 (gDNA) 1____________________________________________________ 總量 25coxI基因的PCR擴增條件：94℃變性 5 min94℃變性 30 s 55℃復(fù)性 30 s 30個循環(huán)72℃延伸 30 s72℃延伸 5 min 擴增完畢后，取出PCR擴增產(chǎn)物于4℃/20℃冰箱保存?zhèn)溆?。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。(2) PCR的基本原理。如果能確定一個保守氨基酸，可將其密碼子的前2個堿基作為3’ 末端。而對于較長的引物，Tm值的計算較為復(fù)雜。 PCR反應(yīng)成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計。④ 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml 柱洗溶液（80%的異丙醇），用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過微型柱，以洗滌DNA樹脂樣品?；靹蚝?，放于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃作用12～48 h，其間不時搖動離心管，使蟲體組織裂解充分。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，2000g離心5min，取上層卵囊加5倍體積的水，3000g離心10min，沉淀再用無菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得純凈的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。2．實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)。若蟲體特別細(xì)?。ɡ缬紫x），可用多條蟲體來提取DNA。l）、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4℃/20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管（500/1500 181。l）、有機架、一次性手套、透明膠帶、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。l、10%SDS 30 181。 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、TGL16G高速臺式離心機、旋渦振蕩器、微量取液器及配套吸頭、微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機架等。 動物寄生蟲病PCR診斷技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)是一
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