動(dòng)物寄生蟲(chóng)病pcr診斷技術(shù)doc(存儲(chǔ)版)
【正文】 CR產(chǎn)物直接用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。切下來(lái)的膠塊放入一新鮮、 ml的離心管中，用電子天平稱(chēng)重并作好記錄。⑥ 重復(fù)步驟“⑤”一次。l，加入3倍體積的Binding buffer，混勻。l Elution Buffer或雙蒸水（pH＞）到UNIQ10柱中，室溫或37℃放置2 min（提高洗脫溫度至5580℃有利于提高DNA的洗脫效率）。l） Reverse primer（Tn01R, 50 pmol/181。 四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（一）寄生蟲(chóng)基因組DNA的提取及純化1．操作中所使用的鑷子和剪刀一定要事先滅菌并于超凈工作臺(tái)中紫外照射1~ h，以保證沒(méi)有污染其它DNA。4．倒膠注意厚度（4~6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。3. 切膠回收時(shí)，對(duì)于高濃度的膠（~2%），每100 mg凝膠加入700 181。8。每次使用后一定要將瓶蓋擰緊，以保持Wash solution中的乙醇含量。2．用微波爐煮膠時(shí)，膠液的量不要超過(guò)三角瓶容量的1/3，否則易溢出。 %TBE瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果。1．PCR反應(yīng)。⑤ 倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回收集管中，高速離心（10000 rpm）1 min。l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，瓊脂糖電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。⑤ 取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ10柱放回收集管中，加入500 181。注意：必須將電泳槽用自來(lái)水充分沖洗，電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會(huì)有其它DNA污染。PCR產(chǎn)物的純化方法一般有兩種：一種是切膠回收，另一種是PCR產(chǎn)物直接回收。④ 結(jié)果觀察：將電泳好的瓊脂糖膠置于紫外透射儀中，打開(kāi)紫外燈，若看到橙紅色的核酸條帶，則說(shuō)明有擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計(jì)該條帶的DNA量；根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)照，通過(guò)線(xiàn)性DNA條帶的相對(duì)位置可初步估計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。如細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1）基因的擴(kuò)增體系為： 試劑 體積（μl） ddH2O 10x PCR Buffer MgCl2 (25 mM) dNTPs ( mM each) 2 Forward primer (100 pmol/ml, JB3) Reverse primer (100 pmol/ml, ) Ex Taq (5 U/ml) 模板 (gDNA) 1____________________________________________________ 總量 25coxI基因的PCR擴(kuò)增條件：94℃變性 5 min94℃變性 30 s 55℃復(fù)性 30 s 30個(gè)循環(huán)72℃延伸 30 s72℃延伸 5 min 擴(kuò)增完畢后，取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃/20℃冰箱保存?zhèn)溆?。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。(2) PCR的基本原理。如果能確定一個(gè)保守氨基酸，可將其密碼子的前2個(gè)堿基作為3’ 末端。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物，Tm值的計(jì)算較為復(fù)雜。 PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計(jì)。④ 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml 柱洗溶液（80%的異丙醇），用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過(guò)微型柱，以洗滌DNA樹(shù)脂樣品。混勻后，放于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃作用12～48 h，其間不時(shí)搖動(dòng)離心管，使蟲(chóng)體組織裂解充分。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，2000g離心5min，取上層卵囊加5倍體積的水，3000g離心10min，沉淀再用無(wú)菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得純凈的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。2．實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)。若蟲(chóng)體特別細(xì)?。ɡ缬紫x(chóng)），可用多條蟲(chóng)體來(lái)提取DNA。l）、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4℃/20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管（500/1500 181。l）、有機(jī)架、一次性手套、透明膠帶、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。l、10%SDS 30 181。 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、TGL16G高速臺(tái)式離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量取液器及配套吸頭、微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機(jī)架等。 動(dòng)物寄生蟲(chóng)病PCR診斷技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)是一
電大資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1