動(dòng)物寄生蟲(chóng)病pcr診斷技術(shù)doc(已修改)
2025-07-29 18:11 本頁(yè)面
【正文】 動(dòng)物寄生蟲(chóng)病PCR診斷技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)是一種既敏感又特異的DNA體外擴(kuò)增方法，它可將一小段目的DNA擴(kuò)增上百萬(wàn)倍，其擴(kuò)增效率使得該方法可檢測(cè)到單個(gè)蟲(chóng)體或僅部分蟲(chóng)體的微量DNA。通過(guò)設(shè)計(jì)種、株特異的引物，此法只擴(kuò)增出種、株特異的PCR產(chǎn)物，具有很高的特異性。而且PCR技術(shù)的操作過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需對(duì)病原進(jìn)行分離純化；同時(shí)可以克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾，直接檢測(cè)到病原體的DNA，既可用于蟲(chóng)種、株的鑒別，動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的臨床診斷，又可用于動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的分子流行病學(xué)調(diào)查。隨著PCR技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆誔CR診斷技術(shù)所涉及實(shí)驗(yàn)的基本原理，全面熟悉PCR診斷技術(shù)的操作過(guò)程，其中包括寄生蟲(chóng)DNA的提取、PCR引物的設(shè)計(jì)、PCR條件的優(yōu)化、對(duì)目的片斷的擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析、PCR產(chǎn)物的純化等等。二、實(shí)驗(yàn)儀器和材料（一）寄生蟲(chóng)基因組DNA的提取及純化。 單個(gè)蟲(chóng)體。 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、TGL16G高速臺(tái)式離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量取液器及配套吸頭、微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機(jī)架等。(1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸（Tri (Hydroxymethyl) AminomethaneHCl，TrisHCl）、氯化鈉、蛋白酶K（25181。g/181。l）、異丙醇（80%）、雙蒸水、滅菌超純水等。(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 181。l 、100 mM TrisHCl（pH ）30 181。l、50 mM EDTA（pH ）150 181。l、10%SDS 30 181。l。(3) WizardTM DNA CleanUp 試劑盒或類似的DNA提取試劑盒。（二）PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1．材料。 提純的蟲(chóng)體DNA。2．器具。 超凈工作臺(tái)、微型高速臺(tái)式離心機(jī)、微量取液器（2/20/200/1000 181。l）、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、4℃/20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管（200/500/1500 181。l）、有機(jī)架、一次性手套、透明膠帶、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。3．試劑。(1) 10PCR Buffer（無(wú)Mg2+）、dNTP（ mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/ml）、瓊脂糖、EB（10mg/ml）、Tris堿、硼酸（Boric acid）、去離子水、EDTA（ mol/L，pH ）、10載樣緩沖液。(2) TBE緩沖液：，充分溶解于800 ml去離子水中，加10ml mol/L EDTA（），用去離子水定容至1000ml。（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1．材料。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2．器具。 TGL16G高速臺(tái)式離心機(jī)；三用電熱恒溫水箱；微量取液器（2/20/200/1000 181。l）、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4℃/20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管（500/1500 181。l）、有機(jī)架、透明膠帶、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手術(shù)刀、保鮮紙等。3．試劑。 瓊脂糖；TBE緩沖液；UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒；UNIQ10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒；異丙醇（80%）等。三、實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)(一) 寄生蟲(chóng)基因組DNA的提取及純化。 應(yīng)根據(jù)研究目的來(lái)決定是從單個(gè)蟲(chóng)體還是多個(gè)蟲(chóng)體提取基因組DNA。寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體的各個(gè)部位都可以作為基因組DNA的抽提材料，如果蟲(chóng)體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學(xué)鑒定以驗(yàn)證其種類。如果蟲(chóng)體較?。ㄐ∮? cm），則應(yīng)使用整條蟲(chóng)體抽取DNA。若蟲(chóng)體特別細(xì)小（例如幼蟲(chóng)），可用多條蟲(chóng)體來(lái)提取DNA。為了獲得高含量、高純度的DNA，最好使用新鮮材料。從凍干或50%70%乙醇保存的寄生蟲(chóng)材料中也可較容易地提取DNA。寄生蟲(chóng)DNA的抽提方法有多種，不同種類的寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體都有其最適合的抽提方法，但各種方法的基本原理都一樣，即先用機(jī)械的方法將蟲(chóng)體組織破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，蟲(chóng)體組織中的細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，將蟲(chóng)體基因組DNA釋放到溶液中。在裂解過(guò)程中，蟲(chóng)體細(xì)胞碎片及大部分蛋白質(zhì)會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被DNA裂解液中的SDS包蓋，通過(guò)離心沉淀，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來(lái)，變性劑也同時(shí)被除去，從
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