【正文】 冰箱10多分鐘，以加速膠的凝固。五、實驗報告實驗報告應(yīng)包括下列內(nèi)容：1. 實驗?zāi)康模?. 引物設(shè)計的基本原則；3. PCR診斷技術(shù)的基本原理；4. PCR診斷技術(shù)的操作過程及實驗結(jié)果；5. PCR擴增及瓊脂糖電泳應(yīng)注意的事項。（二）寄生蟲DNA的PCR擴增及瓊脂糖電泳1．在PCR擴增操作過程中，一定要注意每加完一種試劑后，要換一次槍頭，以免試劑被污染，且加試劑時一定要注意不要加錯、重加或漏加，最后加模板DNA時要用記號筆在管上作好標記，以免結(jié)果混淆。 Tn01R：5’CCGCCCAAACATGCAAGATGGC3’)，建立特異、敏感、快速的特異PCR診斷技術(shù)，用于雞柔嫩艾美爾球蟲感染的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。⑩ 取3~5 181。1 ％的瓊脂糖凝膠中電泳約40~50 min（可適當縮短電泳時間以提高回收效率）。當加樣緩沖液中的溴酚藍遷移至足夠分離DNA片段的距離時，關(guān)閉電源。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負電荷，在外加電場的作用下向正極泳動。這對于獲得好的擴增結(jié)果非常重要。(1) PCR引物設(shè)計。對于原蟲如雞球蟲、隱孢子蟲，將純化好的卵囊3000rpm/min 離心10min，去掉大部分上清后加入與卵囊體積相同的玻璃珠，漩渦震蕩直到有95％卵囊破壁后，即可加入SDS裂解緩沖液及蛋白酶K溶液。最后，在微型柱中加入預(yù)熱的TE緩沖液或超純水，使結(jié)合在微型柱上的DNA充分溶解，通過離心，其洗脫液即為純化的蟲體基因組DNA溶液。 TGL16G高速臺式離心機；三用電熱恒溫水箱；微量取液器（2/20/200/1000 181。l、50 mM EDTA（pH ）150 181。 動物寄生蟲病PCR診斷技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)是一種既敏感又特異的DNA體外擴增方法，它可將一小段目的DNA擴增上百萬倍，其擴增效率使得該方法可檢測到單個蟲體或僅部分蟲體的微量DNA。l、10%SDS 30 181。l）、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4℃/20℃冰箱、紫外透射儀、微型離心管（500/1500 181。2．實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)?；靹蚝螅庞诤銣嘏囵B(yǎng)箱中，37℃作用12～48 h，其間不時搖動離心管，使蟲體組織裂解充分。 PCR反應(yīng)成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計。如果能確定一個保守氨基酸，可將其密碼子的前2個堿基作為3’ 末端。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。④ 結(jié)果觀察：將電泳好的瓊脂糖膠置于紫外透射儀中，打開紫外燈，若看到橙紅色的核酸條帶，則說明有擴增的PCR產(chǎn)物；根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該條帶的DNA量；根據(jù)已知分子量的標準DNA對照，通過線性DNA條帶的相對位置可初步估計擴增產(chǎn)物的分子量。注意：必須將電泳槽用自來水充分沖洗，電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會有其它DNA污染。l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，瓊脂糖電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。1．PCR反應(yīng)。2．用微波爐煮膠時，膠液的量不要超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。8。4．倒膠注意厚度（4~6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。l） Reverse primer（Tn01R, 50 pmol/181。l，加入3倍體積的Binding buffer，混勻。切下來的膠塊放入一新鮮、 ml的離心管中，用電子天平稱重并作好記錄。如果擴增結(jié)果比較滿意，則用凝膠成像系統(tǒng)進行攝影，保存圖像。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。引物的5’末端修飾包括：加酶切位點，標記生物素、熒光、同位素、地高辛等。設(shè)計引物時要遵循以下原則：① 長度不能太長，也不能太短，一般在18～25個堿基左右；② G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%為宜。首先進行蟲體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA CleanUp System使用說明對DNA進行純化。若蟲體較大，用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端部分。3．試劑。(3) WizardTM DNA CleanUp 試劑盒或類似的DNA提取試劑盒。而且PCR技術(shù)的操作過程也相對簡便快捷，無需對病原進行分離純化；同時可以克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾，直接檢測到病原體的DNA，既可用于蟲種、株的鑒別，動物寄生蟲病的臨床診斷，又可用于動物寄生蟲病的分子流行病學(xué)調(diào)查。(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 181。 PCR擴增產(chǎn)物。回收后的蟲體基因組DNA液用WizardTM DNA純化試劑盒進行純化。g/181。 ml離心管中于20℃