動物寄生蟲病pcr診斷技術(shù)-文庫吧
2025-07-02 18:11 本頁面
【正文】 而就可從上清中回收蟲體基因組DNA溶液?；厥蘸蟮南x體基因組DNA液用WizardTM DNA純化試劑盒進行純化。純化時，DNA溶液與純化試劑盒中的清洗樹脂混合后，其混合液在通過微型柱時DNA會結(jié)合在柱上，而其它雜質(zhì)會通過微型柱排出；再用80%異丙醇進行沖洗，去除殘余雜質(zhì)。最后，在微型柱中加入預(yù)熱的TE緩沖液或超純水，使結(jié)合在微型柱上的DNA充分溶解，通過離心，其洗脫液即為純化的蟲體基因組DNA溶液。2．實驗方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1) 蟲體材料的處理(若為新鮮或凍干保存的蟲體，則不需要此步驟)。若蟲體較大，用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端部分。用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2次后，再用超純水反復(fù)沖洗2～3次。若蟲體較小，取一整條蟲體經(jīng)如上洗滌處理。對于雞球蟲，%重鉻酸鉀溶液的卵囊懸液以2000g離心10min，棄重鉻酸鉀溶液。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊20min，2000g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水，3000g離心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗滌一次。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，2000g離心5min，取上層卵囊加5倍體積的水，3000g離心10min，沉淀再用無菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得純凈的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。(2) 蟲體材料的裂解。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過的微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎，加入280181。l的SDS裂解緩沖液，輕輕混勻，再加入20181。l（25181。g/181。l）的蛋白酶K溶液。對于原蟲如雞球蟲、隱孢子蟲，將純化好的卵囊3000rpm/min 離心10min，去掉大部分上清后加入與卵囊體積相同的玻璃珠，漩渦震蕩直到有95％卵囊破壁后，即可加入SDS裂解緩沖液及蛋白酶K溶液?；靹蚝?，放于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃作用12～48 h，其間不時搖動離心管，使蟲體組織裂解充分。(3) 蟲體DNA的抽提和純化。首先進行蟲體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA CleanUp System使用說明對DNA進行純化。方法如下：① 取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約20小時的離心管，旋渦震蕩器震蕩混勻，10000rpm離心2min，上清即為蟲體DNA溶液。將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入1ml清洗樹脂（按50～500181。l懸液/1 ml清洗樹脂的比例），旋渦震蕩混勻。② 取一支5ml的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。③ 將DNA樹脂混合液全部轉(zhuǎn)移到注射器中，用注射器內(nèi)芯推液筒，慢慢地將DNA樹脂混合液推過微型柱，排出廢液。④ 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml 柱洗溶液（80%的異丙醇），用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過微型柱，以洗滌DNA樹脂樣品。⑤ 拔去注射器，10000rpm離心20sec，以除去殘留的異丙醇。⑥ 將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上，在柱中央加入30～50181。l預(yù)熱（60～70℃）的超純水或1TE緩沖液，靜置1 min，10000rpm離心20sec。離心管內(nèi)的液體即為DNA溶液。 ml離心管中于20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃ǘ┘纳xDNA的PCR擴增及瓊脂糖電泳。(1) PCR引物設(shè)計。 PCR反應(yīng)成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計。PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的寡核甘酸片段，使其能有效地與目的片段兩端的序列互補。設(shè)計引物時要遵循以下原則：① 長度不能太長，也不能太短，一般在18～25個堿基左右；② G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%為宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下50%寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度。PCR引物應(yīng)保持合理的G+C含量。含有50%G+C的20個堿基的引物其Tm值約界于56～62℃，這可為有效退火提供足夠的溫度。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。對于短于20個堿基的引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算。而對于較長的引物，Tm值的計算較為復(fù)雜。由于PCR擴增的特異性取決于兩條引物與相應(yīng)模板的結(jié)合，因此，反應(yīng)中退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個Tm值折衷選擇。③ 堿基的組成盡量隨機，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’ 末端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C；④ 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補序列，否則引物自身會折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。這樣二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若引物自身連續(xù)互補堿基達3個以上，就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。⑤ 兩個引物之間不能互補，尤其應(yīng)避免3’ 末端的互補重疊以防止形成引物
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