【正文】 2．切膠回收時，于紫外透射儀中切膠的時間應(yīng)盡可能短，以減少凝膠在紫外光照射下的時間。陽性對照可見分子量大小約530bp的條帶；臨床樣品如有同樣大小條帶判為陽性；陰性對照不見擴增條帶。⑥ ml離心管中，在柱膜中央加入30 181。l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。切膠回收的原理就是通過瓊脂糖凝膠電泳，將要回收的目的片段從凝膠上切下來，然后再通過DNA膠回收試劑盒進行純化，以去除DNA樣品中除了目的基因片段外的所有雜質(zhì)。(2) 瓊脂糖凝膠電泳。 在存在DNA模板、引物、dNTP、適當緩沖液（Mg2+）的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對一對寡核苷酸引物所界定的DNA片段進行擴增。由于PCR擴增的特異性取決于兩條引物與相應(yīng)模板的結(jié)合，因此，反應(yīng)中退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個Tm值折衷選擇。⑤ 拔去注射器，10000rpm離心20sec，以除去殘留的異丙醇。(2) 蟲體材料的裂解。為了獲得高含量、高純度的DNA，最好使用新鮮材料。3．試劑。 單個蟲體。 超凈工作臺、微型高速臺式離心機、微量取液器（2/20/200/1000 181。寄生蟲蟲體的各個部位都可以作為基因組DNA的抽提材料，如果蟲體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學鑒定以驗證其種類。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊20min，2000g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水，3000g離心10min。② 取一支5ml的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。⑧ 若是設(shè)計種或株特異性引物，引物與非特異序列的相似性不能超過70%或有連續(xù)8個以上的互補堿基相同。(1) PCR擴增。在這樣的情況下，往往需要將PCR產(chǎn)物進行純化，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，然后經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性菌落進行測序。④ 將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2 ml收集管的UNIQ10柱中，室溫放置2 min，用臺式離心機高速（8000 rpm）離心1 min。l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。 反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1min、65℃退火2min，共30個循環(huán)，最后72℃后延伸7 min。廢棄膠應(yīng)集中處理，切勿亂丟。4. 切膠回收時的瓊脂糖凝膠電泳，必須將電泳槽用自來水充分沖洗，其電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的，以保證不會有其它DNA污染。3．整個操作過程中，一定要注意不要交叉污染。⑧ 取5~10 181。⑧ ml離心管中，在柱膜中央加30 181。如果PCR擴增產(chǎn)物很特異，且引物長度小于60 bp，則兩種方法都可選用，但如果有非特異性條帶或引物長度大于60 bp時，就必須用切膠純化的方法。待膠凝固后，從膠模上除去封帶，拔出梳子放入電泳槽中，加入足夠量的電泳緩沖液（要求緩沖液液面高出凝膠表面約1 mm）。在實際應(yīng)用中，一般多用30～35個循環(huán)。若引物自身連續(xù)互補堿基達3個以上，就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。離心管內(nèi)的液體即為DNA溶液。l（25181。在裂解過程中，蟲體細胞碎片及大部分蛋白質(zhì)會相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被DNA裂解液中的SDS包蓋，通過離心沉淀，這些復(fù)合物會從溶液中沉淀下來，變性劑也同時被除去，從而就可從上清中回收蟲體基因組DNA溶液。（三）PCR擴增產(chǎn)物的純化1．材料。l）、異丙醇（80%）、雙蒸水、滅菌超純水等。隨著PCR技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它已廣泛應(yīng)用于分子生物學、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學等各個領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。（二）PCR擴增及瓊脂糖電泳1．材料。 瓊脂糖；TBE緩沖液；UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒；UNIQ10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒；異丙醇（80%）等。用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2次后，再用超純水反復(fù)沖洗2～3次。方法如下：① 取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約20小時的離心管，旋渦震蕩器震蕩混勻，10000rpm離心2min，上清即為蟲體DNA溶液。引物的Tm值是指寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下50%寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點、引入翻譯起始密碼子、啟動子序列等。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。（三）PCR擴增產(chǎn)物的純化。③ 按每100 mg瓊脂糖凝膠或100 181。② 把混合液轉(zhuǎn)移到套放于2 ml收集管的UNIQ10柱中，室溫放置2 min，用臺式離心機高速（8000 rpm）離心1 min。l） ddH2O rTaq （5 U/181。也可待膠稍凝固后，放入4℃