實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的數(shù)據(jù)處理及結(jié)果報(bào)告(編輯修改稿)
2024-12-23 17:27 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 信號(hào)由 PCR擴(kuò)增所致，主動(dòng)性參比有其自己的引物和探針。被動(dòng)性參比則為非PCR所致，如 ROX染料，可以校正熒光信號(hào)的非 PCR波動(dòng)。 基本概念 ? 內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)（ Endogenous control） 為一個(gè)出現(xiàn)在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中的特定 RNA或 DNA，通過(guò)使用內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)這種主動(dòng)性參比，對(duì)于加入到每一個(gè)反應(yīng)中的總RNA量的差異，其可以校正靶 mRNA的定量。 ? 外源性?xún)?nèi)標(biāo)（ Exogenous control） 為一個(gè)以已知濃度加入至每個(gè)樣本中的特性確定的 RNA或 DNA，外源性主動(dòng)性參比通常為體外構(gòu)建的，可作為內(nèi)陽(yáng)性質(zhì)控以鑒別由 PCR抑制所致的假陰性。外源性參比也可用來(lái)校正樣本提取或 cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成的效率 。 實(shí)時(shí)熒光 PCR外標(biāo)絕對(duì)定量的數(shù)學(xué)模型 ? 在實(shí)時(shí)熒光 PCR中，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。 實(shí)時(shí)熒光 PCR外標(biāo)絕對(duì)定量的數(shù)學(xué)模型 ? 利用已知起始拷貝數(shù)的外部標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，在現(xiàn)有實(shí)時(shí)熒光 PCR中，大部分以縱坐標(biāo)為 Ct值，橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)，少部分以縱坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)，橫坐標(biāo)為 Ct值。 實(shí)時(shí)熒光 PCR外標(biāo)絕對(duì)定量的數(shù)學(xué)模型 ? 只要獲得未知標(biāo)本的 Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該標(biāo)本的起始拷貝數(shù)，這是采用外標(biāo)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR絕對(duì)定量的基本原理。 基本計(jì)算公式的推導(dǎo) Yn = X ( 1+E )n (1) 其中， Yn 為第 n個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物的量， X為原模板數(shù)， E為擴(kuò)增效率， n為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。 在擴(kuò)增達(dá)到閾值線時(shí)，此時(shí)， n = Ct，于是，擴(kuò)增產(chǎn)物的量為： YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 為熒光信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。在閾值線設(shè)定以后，它就是一個(gè)常數(shù)。（ 2）式兩邊同時(shí)取
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1