實時熒光定量pcr檢測的數(shù)據(jù)處理及結(jié)果報告(編輯修改稿)
2024-12-23 17:27 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 信號由 PCR擴增所致，主動性參比有其自己的引物和探針。被動性參比則為非PCR所致，如 ROX染料，可以校正熒光信號的非 PCR波動。 基本概念 ? 內(nèi)源性內(nèi)標（ Endogenous control） 為一個出現(xiàn)在每一個實驗樣本中的特定 RNA或 DNA，通過使用內(nèi)源性內(nèi)標這種主動性參比，對于加入到每一個反應(yīng)中的總RNA量的差異，其可以校正靶 mRNA的定量。 ? 外源性內(nèi)標（ Exogenous control） 為一個以已知濃度加入至每個樣本中的特性確定的 RNA或 DNA，外源性主動性參比通常為體外構(gòu)建的，可作為內(nèi)陽性質(zhì)控以鑒別由 PCR抑制所致的假陰性。外源性參比也可用來校正樣本提取或 cDNA逆轉(zhuǎn)錄合成的效率 。 實時熒光 PCR外標絕對定量的數(shù)學(xué)模型 ? 在實時熒光 PCR中，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。 實時熒光 PCR外標絕對定量的數(shù)學(xué)模型 ? 利用已知起始拷貝數(shù)的外部標準品可做出標準曲線，在現(xiàn)有實時熒光 PCR中，大部分以縱坐標為 Ct值，橫坐標為起始拷貝數(shù)，少部分以縱坐標為起始拷貝數(shù)，橫坐標為 Ct值。 實時熒光 PCR外標絕對定量的數(shù)學(xué)模型 ? 只要獲得未知標本的 Ct值，即可從標準曲線上計算出該標本的起始拷貝數(shù)，這是采用外標進行實時熒光 PCR絕對定量的基本原理。 基本計算公式的推導(dǎo) Yn = X ( 1+E )n (1) 其中， Yn 為第 n個循環(huán)后擴增產(chǎn)物的量， X為原模板數(shù)， E為擴增效率， n為擴增循環(huán)數(shù)。 在擴增達到閾值線時，此時， n = Ct，于是，擴增產(chǎn)物的量為： YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 為熒光信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。在閾值線設(shè)定以后，它就是一個常數(shù)。（ 2）式兩邊同時取
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