【正文】 可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定?？梢哉f(shuō)，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見(jiàn)傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲(chóng)病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在治療過(guò)程中通過(guò)監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線性相關(guān)關(guān)系。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問(wèn)題得到解決。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門(mén)螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，減少病人痛苦，PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。引物長(zhǎng)度一般為1530個(gè)堿基,G+C含量為4060%,。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。6．研究?jī)?nèi)容PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。在人類基因組中有許多由1015bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測(cè)內(nèi)容PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測(cè)時(shí)間為3h。徐建國(guó)等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計(jì)了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。Fratamico等在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1082222166bp。PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過(guò)程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測(cè)O157: H7。參考文獻(xiàn)[1] 葛忠源。檢測(cè)HIV1載量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J]。昆明醫(yī)學(xué)院。Realtime OPCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。＞），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過(guò)程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果?；蛲蛔兓趦蓷l探針，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無(wú)突變位點(diǎn)的靶序列雜交。① 病原體檢測(cè)：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對(duì)人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測(cè)。③ 腫瘤基因檢測(cè)：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測(cè)出來(lái)。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。服務(wù)流程，提供待檢基因相關(guān)信息； ，支付預(yù)付款（3050%)；（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）； 、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；，主要檢測(cè)引物的特異性和擴(kuò)增效率； ：對(duì)所有樣品上機(jī)檢測(cè)； ，形成報(bào)告。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下： ：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。而新型TaqManMGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺(tái)。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。第三篇：PCR及其改進(jìn)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用PCR及其改進(jìn)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用當(dāng)今社會(huì)，食品中存在的污染情況越來(lái)越嚴(yán)重。食品安全檢測(cè)的指標(biāo)主要包括：成分分析、農(nóng)藥殘留分析、食品添加劑分析、微量元素分析和有害物質(zhì)分析等。PCR及其改進(jìn)技術(shù)概括PCR的是指聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)或者多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)，常用于放大特定的DNA，主要優(yōu)點(diǎn)有簡(jiǎn)潔、方便、敏感、經(jīng)過(guò)改進(jìn)后有了很多較為明顯的優(yōu)點(diǎn)，但是，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù)在某些方面仍然有問(wèn)題。比如，人們?cè)谫I肉的時(shí)候會(huì)考慮到肉里面有沒(méi)有摻假、是否注過(guò)水、屠宰前的家畜有沒(méi)有患有疾病等等。用PCR技術(shù)檢測(cè)食品中攜帶的病菌，例如，豬羊牛肉中的大腸桿菌。在走親訪友的時(shí)候，一般會(huì)送老人和孩子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高的禮品。PCRDGGE技術(shù)是一種聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和變性梯度凝膠電泳技術(shù)結(jié)合在一起的新技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。多重PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)、單一的PCR技術(shù)基礎(chǔ)上改進(jìn)后的技術(shù)。一些黑心商家只注重經(jīng)濟(jì)效益，違規(guī)經(jīng)營(yíng)，生產(chǎn)食品質(zhì)量不合格。,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過(guò)程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:①選定一個(gè)好的引物合成單位。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。物理原因:變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性。,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使 用。開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。PCR技術(shù)的應(yīng)用解決了許多以往血清學(xué)方法無(wú)能為力的問(wèn)題，而且離體蛋白質(zhì)在自然界中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如核酸。目前報(bào)道有十幾種，比較成熟的有APOB、PMCT11PYNZ22等位點(diǎn)。3．STR分型檢驗(yàn)STR為短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandom Repeat）,形成多態(tài)性原理與VNTR相似，只是重復(fù)單位數(shù)36bp，片段長(zhǎng)度100400 bp。檢測(cè)方法靈敏度高，甚至1993年在英國(guó)Colin等報(bào)導(dǎo)用復(fù)合擴(kuò)增對(duì)12個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行研究，總排除率達(dá)1x1014，表明STR復(fù)合擴(kuò)增可以認(rèn)定同一。線粒體多變區(qū)