【正文】 具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽(yáng)性結(jié)果。其特點(diǎn)有：(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè)，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無(wú)復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過(guò)程。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。檢測(cè)方法Ⅰ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3．內(nèi)標(biāo)對(duì)定量PCR的影響若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng)，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。儀器分析法是食品安全檢測(cè)中的最常用的方法。PCR改進(jìn)技術(shù)在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用PCRDGGE在食品檢測(cè)中的應(yīng)用。在食品安全檢測(cè)工作中使用PCR技術(shù)可以很大程度上解決食品安全中存在的問(wèn)題。反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?？苫ハ嗥唇?與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。污染原因(一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū)。呵呵。4．線粒體測(cè)序技術(shù)線粒體是真核細(xì)胞中與 能量代謝有關(guān)的細(xì)胞器，一個(gè)細(xì)胞中線粒體數(shù)的范圍約為1000~10000個(gè)，所以線粒體DNA分析比細(xì)胞核DNA分析要靈敏得多，線粒體測(cè)序分析另一特點(diǎn)是可以對(duì)無(wú)核細(xì)胞檢材，如毛干、紅細(xì)胞骨頭、指甲等進(jìn)行分析，而且細(xì)胞核DNA進(jìn)行測(cè)序分析必須用克隆的方法純化出單一的DNA分子才能進(jìn)行測(cè)序分析，而線粒體DNA可直接經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序。STR位點(diǎn)的突出特點(diǎn)是基因組內(nèi)基因座多，多態(tài)片段短，在生物性檢材個(gè)人識(shí)別鑒定中實(shí)用價(jià)值極高，高度腐敗的檢材只要保存了靶DNA，STR位點(diǎn)就可能擴(kuò)增成功。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照。②減少dNTP的濃度。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。多重PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果精準(zhǔn)，多用于對(duì)番茄、大豆、玉米等轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中。隨著人們生活水平的逐漸提升，人們?cè)絹?lái)越注重養(yǎng)生。PCR改進(jìn)技術(shù)可以簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟、提高檢測(cè)精準(zhǔn)度，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、檢測(cè)精度高等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)工作中的使用率高、使用范圍廣泛。2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。－339。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 ① 基因表達(dá)研究：對(duì)β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。2001年02期[3] 顧鳴，[J]，2003，13(2):154157 [4] (EHEC)[J]，1999，3:3135 [5] 石嵐。Meng等同時(shí)擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長(zhǎng)度分別為632484bp。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。TaqDNA聚合酶單位用量增長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善， DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。PCR還可以用來(lái)檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。定量PCR旨在評(píng)估樣品中靶分子數(shù)，此測(cè)定可以是絕對(duì)的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對(duì)定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說(shuō)幾乎沒(méi)有一個(gè)分子生物學(xué)家沒(méi)有使用過(guò)PCR。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。由于存在同源序列，隨意設(shè)計(jì)的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時(shí)可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計(jì)引物鏈時(shí)應(yīng)充分考慮引物特異性。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。, 反鏈5′（CACATATAAATTATTTCGCTC）3’其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間為ld。2006年[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光。方程式的斜度可以用來(lái)檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R178。結(jié)果證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測(cè)抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測(cè)化療將引起的反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測(cè)致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。在1992年，有些相關(guān)報(bào)道中提出了PCR檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)過(guò)多年的研究和實(shí)踐，將PCR技術(shù)應(yīng)用到食品安全檢測(cè)中得到了很大的回響。多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的具體應(yīng)用。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。需重新設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下,但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本,其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。通過(guò)擴(kuò)增y染色體特異位點(diǎn)鑒定，用Alu序列作對(duì)照，也可以同時(shí)擴(kuò)增x、y染色體特異性片段進(jìn)行鑒定。擴(kuò)增D區(qū)多態(tài)片段測(cè)序，就可以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。所以 DNA的PCR檢驗(yàn)具有獨(dú)到的優(yōu)越性。④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。退火溫度過(guò)低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。使用PCRDGGE技術(shù)進(jìn)行食品檢測(cè)技術(shù)，可以將食品中DNA提取出來(lái)，利用食品的基因和食品的核酸對(duì)食品進(jìn)一步的監(jiān)測(cè)。使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)時(shí)首先需要有專門的儀器，技術(shù)成本高，存在的檢測(cè)結(jié)果偏差大。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)惠包干價(jià)：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對(duì)定量）（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測(cè)試費(fèi)用（3個(gè)重復(fù)）；一個(gè)內(nèi)參免費(fèi)（內(nèi)參3個(gè)重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。: H7分型、檢測(cè)中傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法主要依賴于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期