【正文】 具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽性結(jié)果。其特點有：(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量，進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點定量的不準確性，并且消除了標本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。這項技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實驗中將有很大的用途。檢測方法Ⅰ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3．內(nèi)標對定量PCR的影響若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。儀器分析法是食品安全檢測中的最常用的方法。PCR改進技術(shù)在食品檢測中的具體應(yīng)用PCRDGGE在食品檢測中的應(yīng)用。在食品安全檢測工作中使用PCR技術(shù)可以很大程度上解決食品安全中存在的問題。反應(yīng)體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?？苫ハ嗥唇?與引物互補后,可擴增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。污染原因(一標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染。最好能劃分①標本處理區(qū)。呵呵。4．線粒體測序技術(shù)線粒體是真核細胞中與 能量代謝有關(guān)的細胞器，一個細胞中線粒體數(shù)的范圍約為1000~10000個，所以線粒體DNA分析比細胞核DNA分析要靈敏得多，線粒體測序分析另一特點是可以對無核細胞檢材，如毛干、紅細胞骨頭、指甲等進行分析，而且細胞核DNA進行測序分析必須用克隆的方法純化出單一的DNA分子才能進行測序分析，而線粒體DNA可直接經(jīng)PCR擴增測序。STR位點的突出特點是基因組內(nèi)基因座多，多態(tài)片段短，在生物性檢材個人識別鑒定中實用價值極高，高度腐敗的檢材只要保存了靶DNA，STR位點就可能擴增成功。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照。②減少dNTP的濃度。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。多重PCR技術(shù)操作簡單、快速、結(jié)果精準，多用于對番茄、大豆、玉米等轉(zhuǎn)基因食品的檢測中。隨著人們生活水平的逐漸提升，人們越來越注重養(yǎng)生。PCR改進技術(shù)可以簡化檢測步驟、提高檢測精準度，具有操作簡便、檢測速度快、檢測精度高等優(yōu)點，在食品安全檢測工作中的使用率高、使用范圍廣泛。2．內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。－339。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 ① 基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。2001年02期[3] 顧鳴，[J]，2003，13(2):154157 [4] (EHEC)[J]，1999，3:3135 [5] 石嵐。Meng等同時擴增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為632484bp。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導(dǎo)致非特異DNA擴增。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會不斷地得到擴充和完善， DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。PCR還可以用來檢測遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。人類對于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。定量PCR旨在評估樣品中靶分子數(shù)，此測定可以是絕對的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。目前從事分子生物學的實驗室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個分子生物學家沒有使用過PCR。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個體識別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的又一里程碑。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。由于存在同源序列，隨意設(shè)計的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計引物鏈時應(yīng)充分考慮引物特異性。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。, 反鏈5′（CACATATAAATTATTTCGCTC）3’其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld。2006年[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光。方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關(guān)系數(shù)（R178。結(jié)果證明，實時熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測化療將引起的反應(yīng)。實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(yōu)勢。在1992年，有些相關(guān)報道中提出了PCR檢測技術(shù)，經(jīng)過多年的研究和實踐，將PCR技術(shù)應(yīng)用到食品安全檢測中得到了很大的回響。多重PCR技術(shù)在食品檢測中的具體應(yīng)用。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。需重新設(shè)計引物。PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下,但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。通過擴增y染色體特異位點鑒定，用Alu序列作對照，也可以同時擴增x、y染色體特異性片段進行鑒定。擴增D區(qū)多態(tài)片段測序，就可以進行個體識別。所以 DNA的PCR檢驗具有獨到的優(yōu)越性。④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。使用PCRDGGE技術(shù)進行食品檢測技術(shù)，可以將食品中DNA提取出來，利用食品的基因和食品的核酸對食品進一步的監(jiān)測。使用實時定量PCR技術(shù)時首先需要有專門的儀器，技術(shù)成本高，存在的檢測結(jié)果偏差大。實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡介1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。收費標準優(yōu)惠包干價：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費用，上機測試費用（3個重復(fù)）；一個內(nèi)參免費（內(nèi)參3個重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如圖1所示）。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。實時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。: H7分型、檢測中傳統(tǒng)的細菌分類方法主要依賴于細菌的形態(tài)學、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測分析PCR擴增產(chǎn)物的方法。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠比血清學或等方法確實可靠。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期