【正文】 高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸。PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因(一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染。標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染。有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、,因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.(四實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對(duì)照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽性對(duì)照,其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下,但陽性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本,其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對(duì)照。:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照。被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。 (一合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū)。②PCR反應(yīng)液制備區(qū)。③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)。④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使 用。(五設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最 低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一 管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。呵呵 其實(shí) DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。呵呵。第五篇：PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR技術(shù)可以從一滴血、一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量 DNA產(chǎn)物供分析檢驗(yàn)。PCR技術(shù)的應(yīng)用解決了許多以往血清學(xué)方法無能為力的問題，而且離體蛋白質(zhì)在自然界中的穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如核酸。所以 DNA的PCR檢驗(yàn)具有獨(dú)到的優(yōu)越性。目前，人們已建立了各種生物樣品如血液、血斑、精液、性交混合物、肌肉、單根毛發(fā)、上皮細(xì)胞、牙齒、骨骼中制備 DNA的實(shí)驗(yàn)方法。目前PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要有： 1．VNTR多態(tài)性該方法擴(kuò)增位點(diǎn)靶基因多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)核心序列數(shù)目不同而形成。目前報(bào)道有十幾種，比較成熟的有APOB、PMCT11PYNZ22等位點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)單，結(jié)果易分析，缺點(diǎn)是在片段長(zhǎng)度差異較大時(shí)，長(zhǎng)片段可能被漏擴(kuò)增，引起錯(cuò)誤判斷。2．性別鑒定PCR性別鑒定目前應(yīng)用于各種生物檢材檢驗(yàn)。通過擴(kuò)增y染色體特異位點(diǎn)鑒定，用Alu序列作對(duì)照，也可以同時(shí)擴(kuò)增x、y染色體特異性片段進(jìn)行鑒定。3．STR分型檢驗(yàn)STR為短串聯(lián)重復(fù)序列（Short Tandom Repeat）,形成多態(tài)性原理與VNTR相似，只是重復(fù)單位數(shù)36bp，片段長(zhǎng)度100400 bp。STR與VNTR分布也不同，VNTR主要分布在染色體端粒，而STR則存在于整個(gè)基因組，估計(jì)人類基因組有50萬個(gè)STR位點(diǎn)，因此是巨大的遺傳差異研究對(duì)象。STR位點(diǎn)的突出特點(diǎn)是基因組內(nèi)基因座多，多態(tài)片段短，在生物性檢材個(gè)人識(shí)別鑒定中實(shí)用價(jià)值極高，高度腐敗的檢材只要保存了靶DNA，STR位點(diǎn)就可能擴(kuò)增成功。STR的PCR擴(kuò)增時(shí)間短，變性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一個(gè)半小時(shí)左右完成30個(gè)循環(huán)。檢測(cè)方法靈敏度高，甚至1993年在英國(guó)Colin等報(bào)導(dǎo)用復(fù)合擴(kuò)增對(duì)12個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行研究，總排除率達(dá)1x1014，表明STR復(fù)合擴(kuò)增可以認(rèn)定同一。STR在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)在于：(1)操作方便簡(jiǎn)便，通過多位點(diǎn)累計(jì)，可以同一認(rèn)定；(2)靈敏度高，復(fù)合擴(kuò)增可以節(jié)約檢材；(3)片段較小，適宜部分降解DNA的擴(kuò)增。4．線粒體測(cè)序技術(shù)線粒體是真核細(xì)胞中與 能量代謝有關(guān)的細(xì)胞器，一個(gè)細(xì)胞中線粒體數(shù)的范圍約為1000~10000個(gè)，所以線粒體DNA分析比細(xì)胞核DNA分析要靈敏得多，線粒體測(cè)序分析另一特點(diǎn)是可以對(duì)無核細(xì)胞檢材，如毛干、紅細(xì)胞骨頭、指甲等進(jìn)行分析，而且細(xì)胞核DNA進(jìn)行測(cè)序分析必須用克隆的方法純化出單一的DNA分子才能進(jìn)行測(cè)序分析，而線粒體DNA可直接經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序。進(jìn)一步研究表明，線粒體是母系遺傳方式遺傳的，所以一母所生子女應(yīng)有相同的線粒體DNA序列。線粒體多變區(qū)在D區(qū)。擴(kuò)增D區(qū)多態(tài)片段測(cè)序，就可以進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。目前，世界上絕大多數(shù)法醫(yī) DNA鑒定實(shí)驗(yàn)室主要工作就是應(yīng)用STRPCR分型檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定等工作。