【正文】 產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標。2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。由于qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨到優(yōu)勢。食品安全檢測的主要內(nèi)容食品安全檢測的內(nèi)容比較復(fù)雜，涉及面廣泛，主要的檢測內(nèi)容是：食品污染成分、食品營養(yǎng)成分、食品是否具有添加劑以及食品質(zhì)量的總體檢測等等。食品安全檢測人員對食品檢測的檢驗要求有三部分內(nèi)容：①要嚴格按照標準中規(guī)定的分析步驟依次進行，在實驗室中，要對所有的不安全因素采取防護措施，其中，不安全因素都包括：爆炸、腐蝕、燒傷等等；②在實驗室中，檢測人員需要準確、詳細地記錄檢測的方法和數(shù)據(jù)等信息；③在食品安全檢測完成后，檢測人員需要檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和整理工作。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在食品檢測中的具體應(yīng)用檢測食品中所含成分。在1992年，有些相關(guān)報道中提出了PCR檢測技術(shù)，經(jīng)過多年的研究和實踐，將PCR技術(shù)應(yīng)用到食品安全檢測中得到了很大的回響。食物中含有的營養(yǎng)成分和主要物質(zhì)都是人們關(guān)心的重點。DGGE技術(shù)又稱變性梯度凝膠電泳技術(shù)。實時定量PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用。多重PCR技術(shù)在食品檢測中的具體應(yīng)用。隨著毒豆芽、瘦肉精、地溝油等各種食品污染問題的產(chǎn)生，人們對食品的質(zhì)量產(chǎn)生了很大的懷疑。作者簡介：陳冬梅，碩士，伊犁州食品藥品檢驗所，高級工程師，食品負責人第四篇：PCR技術(shù)原理及心得.PCR技術(shù)原理與心得體會PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),有些最好于當日電泳檢測,大于48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。⑤模板核酸變性不徹底。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效?；?00ul,應(yīng)用多大體積進行PCR擴增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。需重新設(shè)計引物。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。其對策有:①必要時重新設(shè)計引物。PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。③適當降低Mg2+濃度。標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標本間污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管,開蓋時、,因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題.(四實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下,但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。②PCR反應(yīng)液制備區(qū)。(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。第五篇：PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR技術(shù)可以從一滴血、一個細胞中擴增出足量 DNA產(chǎn)物供分析檢驗。目前PCR技術(shù)的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要有： 1．VNTR多態(tài)性該方法擴增位點靶基因多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)核心序列數(shù)目不同而形成。通過擴增y染色體特異位點鑒定，用Alu序列作對照，也可以同時擴增x、y染色體特異性片段進行鑒定。STR的PCR擴增時間短，變性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一個半小時左右完成30個循環(huán)。進一步研究表明，線粒體是母系遺傳方式遺傳的，所以一母所生子女應(yīng)有相同的線粒體DNA序列。擴增D區(qū)多態(tài)片段測序，就可以進行個體識別。STR在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用優(yōu)點在于：(1)操作方便簡便，通過多位點累計，可以同一認定；(2)靈敏度高，復(fù)合擴增可以節(jié)約檢材；(3)片段較小，適宜部分降解DNA的擴增。STR與VNTR分布也不同，VNTR主要分布在染色體端粒，而STR則存在于整個基因組，估計人類基因組有50萬個STR位點，因此是巨大的遺傳差異研究對象。該方法簡單，結(jié)果易分析，缺點是在片段長度差異較大時，長片段可能被漏擴增，引起錯誤判斷。所以 DNA的PCR檢驗具有獨到的優(yōu)越性。呵呵 其實 DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。(五設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最 低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一 管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，20℃保存。④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。 (一合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。污染的監(jiān)測一個好的實驗室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽就可形成假陽性。PCR反應(yīng)的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。其對策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,適當增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。這種假陽性可用以下方法解決:①操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。引物設(shè)計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR 擴增時,擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。通過對食品進行安全檢驗，分析食品中所含的成分和營養(yǎng)比例，促進食品事物的健康、安全發(fā)展，提高人們的飲食安全。多重PCR技術(shù)一次可以?z測出多種病菌，像是大腸埃希菌、沙門菌屬、霍亂弧菌等菌類均可一次檢測出來。實時定量PCR技術(shù)主要采用的是完全閉管檢測，實時定量PCR技術(shù)是PCR改進技術(shù)中操作最方便、結(jié)果最準確、用時最短的一種。使用PCRDGGE技術(shù)進行食品檢測技術(shù)，可以將食品中DNA提取出來，利用食品的基因和食品的核酸對食品進一步的監(jiān)測。有很多經(jīng)過加工的食品，人們對肉眼看不出食品質(zhì)量的好壞，那么如何判斷食品中含有的營養(yǎng)成分，就需要食品檢測人員使用PCR技術(shù)進行檢測。檢測食品中包含的營養(yǎng)成分。為了保證消費者的合法權(quán)益和身體健康，食品安全檢測人員可以使用PCR技術(shù)方便、快捷的將食品中存在的不合格現(xiàn)象檢測出來，降低食品安全隱患。使用實時定量PCR技術(shù)時首先需要有專門的儀器，技術(shù)成本高，存在的檢測結(jié)果偏差大。常用的食品安全就按冊方法有兩種：一種是傳統(tǒng)的常規(guī)分析法，一種是儀器分析法。豬肉注水、奶粉摻假、蔬菜有機農(nóng)藥含量超標等等，嚴重影響著人們的身體健康。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物