高效定量(cad)pcr技術(shù)商業(yè)計劃書(編輯修改稿)
2024-08-30 07:34 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 CR的基本原理與反應(yīng)條件和熒光(TaqMan)PCR完全一樣，所以可以在目前流行的任何一種PCR儀上進行，不必開發(fā)新的配套儀器。. PCR所用DNA合成酶的分析DNA合成酶是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接控制反應(yīng)結(jié)果。目前世界上已開發(fā)出許多種，每一種的復制保真度和準確度大不相同。下表列出八種DNA合成酶的相對準確度。從表中可以看出，高效定量(CAD)PCR所用的酶，PfuUltra，比熒光(TaqMan)PCR所用的酶，Taq，高出18倍。這從一個側(cè)面說明為什么高效定量(CAD)PCR有如此之高的準確度。此外，高效定量(CAD)PCR所用DNA合成酶具有極高的熱穩(wěn)定性，比熒光(TaqMan)PCR所用合成酶高出30多倍，幾乎不存在因高溫而失活的問題，成為臨床檢測精確測定的又一保證。. 高效定量(CAD)PCR與熒光(TaqMan)PCR的實驗比較 經(jīng)過如此改進的高效定量(CAD)PCR與熒光(TaqMan)PCR相比，各方面指標都有顯著提高。某公司進行了一系列的對照實驗，以期比較二者的優(yōu)劣，這里僅以一最具代表性實驗為例，詳細證明高效定量(CAD)PCR的明顯優(yōu)勢。. 實驗條件實驗設(shè)計：將熒光(TaqMan)PCR與高效定量(CAD)PCR兩組反應(yīng)，在除了各自的酶系之外完全相同的條件下同時進行，分析兩者的結(jié)果。實驗儀器：ABI公司生產(chǎn)的實時PCR儀，型號為Prizm7000。該型號PCR儀是目前最先進的國際標準熒光(TaqMan)PCR儀。PCR擴增模板：使用購買ABI公司的PCR儀時附送的標準人類基因組DNA，用量從10至10000拷貝。此模板是ABI公司用來演示其PCR儀功能正常與否的標準產(chǎn)品，具有最高的純凈度和穩(wěn)定性。使用此模板，可以避免標本樣品采集與制備過程中可能出現(xiàn)的實驗誤差，避免了然后DNA合成酶抑制因子存在的可能，創(chuàng)造了熒光(TaqMan)PCR的最佳反應(yīng)條件。引物和探針：同樣使用ABI公司PCR儀附送的、和標準模板配套的20倍濃度引物、探針混合物，稀釋使用，數(shù)據(jù)分析：使用與PCR儀配套的ABI公司分析軟件，基準線為6至20周期，.DNA合成酶和其他試劑：熒光(TaqMan)PCR就使用PCR儀附送的配套標準合成酶和試劑，以使熒光(TaqMan)PCR在最佳條件下進行。高效定量(CAD)PCR則使用某公司自己生產(chǎn)的，專門用于高效定量(CAD)PCR的高保真度DNA合成酶系及配套試劑。綜上所述，如此實驗設(shè)計創(chuàng)造了熒光(TaqMan)PCR的最適合反應(yīng)條件，以期獲得熒光(TaqMan)PCR的最佳結(jié)果。而在日常臨床熒光(TaqMan)PCR檢測實踐中，由於實驗條件千變?nèi)f化，結(jié)果一般遠遠低于此處的最佳結(jié)果。我們的目的就是要證明，在普通條件下高效定量(CAD)PCR的檢測結(jié)果，可以輕易超過在最佳條件下熒光(TaqMan)PCR的結(jié)果，那么在臨床實踐中，高效定量(CAD)PCR無疑比熒光(TaqMan)PCR有著巨大優(yōu)勢。. 實驗結(jié)果根據(jù)上述實驗條件加樣后，放入PCR儀，開啟實時監(jiān)測和自動分析，經(jīng)過約兩小時，PCR儀自動打印出實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)貼于此處。熒光(TaqMan)PCRCt = + R2: Efficiency: %.01.1110K高效定量(CAD)PCRCt = + R2: Efficiency: %.01.1110KSNP單鹼基突變 如圖所示，上圖為熒光(TaqMan)PCR的結(jié)果，下圖為高效定量(CAD)PCR的結(jié)果。右邊為標準曲線，左邊為熒光強度隨時間變化的曲線，從左到右四條曲線，代表四種DNA模板濃度，分別為10000，1000，100，10個DNA拷貝。. 結(jié)果分析由上述結(jié)果可以清楚地看到兩種PCR技術(shù)的優(yōu)劣。熒光強度曲線分析：典型的熒光強度曲線應(yīng)該呈S型，在反應(yīng)初期，因為沒有足夠的DNA拷貝被復制出來，也就沒有足夠的熒光分子被激活，光吸收值保持為零。中間部分光吸收值迅速上升，代表DNA拷貝的快速增加。至反應(yīng)末期，因核苷酸分子逐漸被用盡，無法再合成出更多的DNA拷貝，光吸收值的上升也就逐漸停止，曲線趨向平緩。由左上圖可見，熒光(TaqMan)PCR的四條曲線隨所用的DNA模板濃度降低而越變越矮，最后一條甚至不足第一條峰值的一半，究其原因，主要是由所用DNA合成酶的準確性和熱穩(wěn)定性過低造成的。用于準確性低，產(chǎn)生出大量非目標DNA，為目標DNA設(shè)計的探針自然無法將其檢測出來，導致曲線變低。而熱穩(wěn)定性低使得DNA合成酶在反應(yīng)后期基本失活，即使時間再長，也無法再合成出DNA拷貝。另外，本實驗全部是在最佳條件下進行，反應(yīng)環(huán)境中不存在DNA合成酶抑制因子。而臨床實踐中制備出來的DNA模板，會含有多種此類因子，破壞酶的活性，在低模板濃度條件下，極有可能造成光吸收值過低至不可檢出的程度，導致假陰性的出現(xiàn)。左下圖則顯示，與熒光(TaqMan)PCR不同，高效定量(CAD)PCR的四條熒光強度曲線全部呈完美的S型，說明了該技術(shù)無與倫比的保真度、準確性和穩(wěn)定性。而且高效定量(CAD)PCR所用的DNA合成酶對各種抑制因子均不敏感，臨床制備出來的模板也不會影響反應(yīng)結(jié)果。標準曲線分析：對照兩組標準曲線的擴增效率(Efficiency)，可以從另一個角度說明高效定量(CAD)PCR的優(yōu)越。擴增效率是指PCR每一次擴增反應(yīng)能夠產(chǎn)生多少個DNA拷貝。熒光(TaqMan)%，或者說，每一百次擴增反應(yīng)，只有約88次能產(chǎn)生完整的DNA分子，而且這還是在最佳反應(yīng)條件下的結(jié)果。與之對照，高效定量(CAD)PCR的擴增效率幾乎達到百分之百，比前者的最佳結(jié)果高出14%?？梢灶A測，在未來臨床實際應(yīng)用中，高效定量(CAD)PCR的擴增效率必將遠遠高于熒光(TaqMan)PCR的表現(xiàn)。以上分析清楚地表明，高效定量(CAD)PCR有著熒光(TaqMan)PCR無法比擬的巨大優(yōu)勢，一旦應(yīng)用于臨床檢驗，必將對中國的醫(yī)療檢測行業(yè)帶來重大突破?；仡欉^去數(shù)月中國抗擊SARS的過程中，一直沒有有效的臨床實驗室檢測手段，以致大量疑似患者被長時間隔離。雖有多家研究單位和公司宣布成功開發(fā)出檢測試劑盒，但陽性檢出率最高達到百分之七八十，有的甚至低到百分之十幾。仔細分析起來，如此高的假陰性比例，雖然有多種可能性，但熒光(TaqMan)PCR本身的固有缺陷很可能是主要原因。. 高效定量(CAD)PCR技術(shù)的操作及產(chǎn)品高效定量(CAD)PCR可以應(yīng)用在幾乎所有疾病病源檢測上，只要該疾病病源體基因被部分解碼。從被解碼的病源基因序列中選出最具特異性的兩個片段，各長20至50鹼基，分別合成出引物DNA(Primer)和檢測探針(Probe)。然后從病源標本中提取出病源DNA(若是RNA，須增加反轉(zhuǎn)錄步驟)，加入引物，探針，酶，及核苷酸，同置于封閉容器內(nèi)，在PCR儀上開始反應(yīng)，若儀器有實時監(jiān)測功能，則反應(yīng)結(jié)束后，定量的檢測結(jié)果同時打印出來，整個過程約2小時。高效定量(CAD)PCR與特異引物/探針的關(guān)系類似槍與子彈
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