【正文】 （ Real Time PCR） 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 生物秀 — 專心做生物！ 主要內(nèi)容 Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測方法 Real Time PCR 檢測系統(tǒng) 差異顯示結(jié)果驗(yàn)證 定性分析 絕對定量 相對定量 病毒和病原菌檢測 基因芯片結(jié)果驗(yàn)證 siRNA效果確認(rèn) mRNA表達(dá)量分析 Real Time PCR 用途 操作簡單，無需電泳，檢測快速，降低污染幾率， 適用于大量樣品檢測，檢測靈敏度高； 可以在寬廣范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 生物品種鑒定 病毒和病原菌定量分析 導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析 GMO定量檢測 SNP解析 激發(fā)光 發(fā)射光 Ct值 Real Time PCR 原理 使用 Real Time PCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。 Real Time PCR 生物秀 — 專心做生物！ 同一個樣品重復(fù) 96次 PCR的擴(kuò)增曲線 Real Time PCR 原理 Ct值 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR擴(kuò)增過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 ( C代表 Cycle， t代表 threshold） Ct值概念 閾值：在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上 設(shè)定的熒光檢出界限。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號積累的整個 PCR進(jìn)程，最后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的樣品進(jìn)行定量分析。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測方法 Real Time PCR 檢測系統(tǒng) 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR檢測方法 ? 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) ? 熒光探針法 TaqMan probe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpions probe Amplifluor probe 生物秀 — 專心做生物！ SYBR Green I是一種結(jié)合于所有 dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) SYBR Green I 生物秀 — 專心做生物！ 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I)作用機(jī)理示意圖 熱變性 引物退火 延伸反應(yīng) 生物秀 — 專心做生物！ TaqMan探針為一寡核苷酸， 5’端標(biāo)記一個報(bào)告熒光基團(tuán) (Reporter)， 3’端標(biāo)記一個淬滅熒光基團(tuán) (Quencher)。 TaqMan Probe法作用機(jī)理 TaqMan Probe 法作用機(jī)理示意圖 熱變性 引物和探針與模板退火 延伸反應(yīng) 探針 報(bào)告基團(tuán) 淬滅基團(tuán) 探針 DNA聚合酶 引物 R R R R 生物秀 — 專心做生物！ Cycling probe為一寡核苷酸， 5’端標(biāo)記一個熒光報(bào)告基團(tuán) (Reporter)， 3’端標(biāo)記一個熒光淬滅基團(tuán)(Quencher)，寡核苷酸為 DNA/RNA雜合體。 Q R 核糖核苷酸 Cycling Probe法 生物秀 — 專心做生物！ 熱變性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 SYBR Green I法 vs Probe法 SYBR Green I 法 ◆優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜、使用方便、 無需合成特異性探針。 ◆缺點(diǎn)：引物要求高（要求特異性擴(kuò)增）、不能進(jìn)行多重 PCR。 Probe法 ◆優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重 PCR。 ◆缺點(diǎn)：需要設(shè)計(jì)特異性探針，成本高、有時(shí)設(shè)計(jì)困難。 以前對 PCR引物的選擇、 PCR試劑的優(yōu)化 經(jīng)驗(yàn)不足， Probe法較為廣用。 但是 ??? 使用 SYBR Green I 進(jìn)行檢測的問題點(diǎn) ● SYBR Green I與雙鏈 DNA進(jìn)行結(jié)合后散収熒光，因此如果反 應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增，非特異性 DNA也將同時(shí)被檢測， 從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。 ● Primer Dimer的產(chǎn)生 二條引物的 3’端具有互補(bǔ)序列時(shí)，引物自身也會進(jìn)行擴(kuò)增， 產(chǎn)生短鏈 DNA片段（ Primer Dimer）。 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ GATC CTAG GATC CTAG 使用 SYBR Green I 進(jìn)行定量 PCR 的 Key Point Primer： 設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增，是使用 SYBR Green I 進(jìn)行定量 PCR 的 Key Point。 TaKaRa公司可以提供 最佳引物的設(shè)計(jì)合成服務(wù) Real Time 進(jìn)入 SYBR Green I 時(shí)代 保證以上條件，使用 SYBR Green I將 會更加便宜，更為方便，并擁有良 好的特異性。 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測方法 Real Time PCR 檢測系統(tǒng) 生物秀 — 專心做生物！ 生產(chǎn)廠商 儀器名稱 TaKaRa公司 TP800 Applied Biosystems公司 ABI PRISM 7700、 7000、 7300、 7900HT、 7500Fast Roche公司 LightCycler174。 、 LightCycler174。 480 Cepheid公司 Smart Cycler、 Smart Cycler II、 Smart Cycler 174。 TD BioRad公司 iCycler iQ、 iQ5 RealTime PCR Detection System Corbett Research公司 Rotorgene202 Rotorgene3000 、 Rotorgene6000 MJ Research公司 Opticon、 MJ Mini Cycler、 MiniOpticon Stratagene公司 Mx4000174。、 Mx3000P174。 、 Mx3005PTM 杭州博日 LINEGENE FQD33A、 LINEGENE FQD66A Real Time PCR檢測系統(tǒng) 簡介 LightCycler174。 480 Rotorgene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINEGENE FQD66A ABI PRISM 7500 iQ5 RealTime PCR Detection System TaKaRa TP800 各公司 Real Time PCR檢測系統(tǒng)比較 儀器名稱 反應(yīng)孔數(shù) 反應(yīng)孔間 獨(dú)立性 檢出通道 升降溫速度 Tube ROX熒光 校正功能 TaKaRa TP800 96 無 25 快 Tube 無 ABI7000 96 無 4 快、慢兩種 8聯(lián)管、 專用 Cap 有 ABI7500 Fast 5 快 Light 32 無 6 快 專用毛細(xì)玻璃管 無 Light Cycler 480 96 or 384 5 快 專用板 Smart Cycler 16 (6 16 ) 有 4 快 專用、塑料＋石英 無 RotorGene 3000 36 () 72 () 無 4 慢 Tube, Tube 無 MiniOpticon 48 無 2 快 Tube 無 iQ5 RealTime PCR Detection System 96 無 5 快 Tube 無 LINEGENE FQD66A 66 無 4 快 Tube 無 Mx3000P174。 96 無 4 慢 8聯(lián)管 或單管 有 Mx3005PTM 5 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time RTPCR反應(yīng) ? 以 RNA為起始實(shí)驗(yàn)材料時(shí)。 Real Time PCR反應(yīng) ? 以 DNA為起始實(shí)驗(yàn)材料時(shí)。 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ? One Step RTPCR和 Two Step RTPCR的選擇 ? RT Primer的選擇 ? Total RNA中 genomic DNA混入的對策 Real Time PCR反應(yīng) ? Real Time PCR引物及探針的設(shè)計(jì) ? 引物反應(yīng)性確認(rèn) ? PCR條件優(yōu)化順序 生物秀 — 專心做生物！ One Step RTPCR 和 Two Step RTPCR的選擇 Two Step RTPCR One Step RTPCR cDNA分裝 適用于 mRNA表達(dá)量解析 ? Two Step RTPCR效率高 ? 使用 Random和 OligodT 引物可以制備 cDNA pool ? cDNA可長期保存 適用于病毒、病原菌檢測 ? 操作簡單 ? 污染幾率低 生物秀 — 專心做生物！ Random 6mer Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer RT Primer的選擇 Random 6mer Primer Gene specific Primer Oligo dT Primer 生物秀 — 專心做生物！ RT Primer的選擇 Random 6mer 1,500base 目的片段 5’ 3’ R F 目的片段在 mRNA任何位置都能使用。通常 mRNA表達(dá)量分析最適。 目的片段在距 Poly(A) Tail 。 One Step RTPCR只能使用Gene specific Primer， 不適用于 mRNA表達(dá)量分析等復(fù)數(shù)基因的檢出。 5’ 3’ Gene specific Primer 目的片段 R F AAAA 5’ 3’ 目的片段 R F 1,500base Oligo dT Primer 生物秀 — 專心做生物！ mRNA Primer F Primer R 目的片段 RTPCR 外顯子 1 基因組 DNA PCR 外顯子 2 外顯子 3 外顯子 1 外顯子 2 外顯子 3 內(nèi)含子 2 內(nèi)含子 1 Primer F Primer R 目的片段 Total RNA中 Genomic DNA混入的對策 此種情況必須采用 DNase I處理，去除基因組 DNA 生物秀 — 專心做生物！ mRNA 基因組 DNA 目的片段 RTPCR 外顯子 1 外顯子 2 外顯子 3 Primer F Primer R Primer F