rt-pcr博士班實(shí)驗(yàn)課(已修改)
2024-10-12 16:47 本頁(yè)面
【正文】 RTPCR 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心 授課老師：王 偉 RTPCR是將 RNA模板的反轉(zhuǎn)錄（ RT） ,和 cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（ PCR）相結(jié)合的技術(shù)。此技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，分析表達(dá)的水平，構(gòu)建克隆 cDNA產(chǎn)物。 RTPCR試劑盒 目的 主要試劑 RTPCR可分為一步法，兩步法： 兩步法的優(yōu)點(diǎn)： （ 1） RT和 PCR反應(yīng)分別在 最優(yōu)化 的條件下進(jìn)行，使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合對(duì)付 未知模板 或者是較為 困難的模板 。 （ 2）多個(gè)基因的 RTPCR。 兩步法通常是取第一步反應(yīng)產(chǎn)物的 1/10進(jìn)行第二步反應(yīng)，使得其靈敏度不如前者高。 兩步法反應(yīng)： 第一步反應(yīng)體系 總 RNA 110 μ l 引物 2 μ l dNTP 4 μ l DEPCH2O 16 μ l 70 ℃ 加熱 5分鐘，置于冰上 10 RT Buffer 2 μ l RNase inhibitor 1 μ l AMV逆轉(zhuǎn)錄 1 μ l 總體積 20 μ l 42 ℃ 加熱 60分鐘 加 RNaseH 1μ l(1unit)37 ℃ 作用 20分鐘降解 RNA 95 ℃ 加熱 5分鐘，酶失活 95 ℃ 加熱 5分鐘，酶失活 用無(wú)核酸酶污染水將反應(yīng)體系稀釋到 50μ l，取 2~5μ l進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 兩步法反應(yīng)： 第二步反應(yīng)體系 10 PCR Buffer 5μ l cDNA μ l 正義引物 （ P1） 2μ l 反義引物 （ P2） 2μ l Taq DNA聚合酶 1μ l MgCl2 4μ l dNTP 2μ
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