rt-pcr博士班實(shí)驗(yàn)課-資料下載頁(yè)
2024-10-04 16:47本頁(yè)面
【正文】 低的。 引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的，部分長(zhǎng)度的 cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取 539。末端序列及從帶有 二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域 或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的 終止位點(diǎn) 的 RNA模板獲得 cDNA。 為了獲得最長(zhǎng)的 cDNA，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè) RNA樣品中引物與 RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到 250ng每 20μ l反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總RNA合成的 cDNA主要是核糖體 RNA，所以 模板 一般選用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。 它同大多數(shù)真核細(xì)胞 mRNA 339。端所發(fā)現(xiàn)的 poly(A)尾雜交。因?yàn)?poly(A)+RNA大概占總 RNA的 1%到 2％，所以與使用隨機(jī)引物相比， cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性， oligo(dT)一般不需要對(duì) RNA和引物的比例及 poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每 20μ l反應(yīng)體系使用 g oligo(dT)。 oligo(dT)1218適用于多數(shù) RTPCR。 oligo(dT)20，因?yàn)槠錈岱€(wěn)定性較好，適用于較高的保溫溫度。 基因特異性引物（ GSP） 對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。 GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同 RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或 oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計(jì) PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) GSP的設(shè)計(jì)。建議在 20μ l的第一鏈合成反應(yīng)體系中使用 1pmol反義 GSP。 隨機(jī)引物 適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的 RNA。適用于 rRNA、 mRNA、tRNA 等所有 RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。主要用于單一模板的 RTPCR反應(yīng)。 Oligo dT 適用于具有 PolyA尾巴的 RNA。（原核生物的 RNA、真核生物的 rRNA和 tRNA不具有 PolyA尾巴。）由于 Oligo dT要結(jié)合到PolyA 尾巴上，所以對(duì) RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也 會(huì)使全長(zhǎng) cDNA合成量大大減少。 基因特異性引物 與模板序列互補(bǔ)的引物，適用于目的序列已知的情況。 RTPCR引物的選擇總結(jié)
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