rt-pcr博士班實驗課-wenkub
2022-10-23 16:47:21 本頁面
【正文】 S1核酸酶 消化該環(huán) ,即可進一步克隆。 （ 2）多個基因的 RTPCR。RTPCR 分子生物學實驗中心 授課老師：王 偉 RTPCR是將 RNA模板的反轉錄（ RT） ,和 cDNA的聚合酶鏈式擴增（ PCR）相結合的技術。 兩步法通常是取第一步反應產(chǎn)物的 1/10進行第二步反應，使得其靈敏度不如前者高。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 539。該反應有 3個主要優(yōu)點 : (1) 非常有效 。 ? 如果需要平行分析多個 RNA 樣品，首選方法為一步法 RT－ PCR。被RNaseH活性所降解的 RNA模板不能再作為合成 cDNA的有效底物，降低了 cDNA合成的產(chǎn)量和長度。 C45176。 C ThermoScript? RT 42176。 C45176。 C 42176。 引物在整個轉錄本的多個位點退火，產(chǎn)生短的，部分長度的 cDNA。隨機引物的起始濃度范圍為50到 250ng每 20μ l反應體系。端所發(fā)現(xiàn)的 poly(A)尾雜交。 oligo(dT)1218適用于多數(shù) RTPCR。用于設計 PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉錄反應 GSP的設計。主要用于單一模板的 RTPCR反應。 基因特異性引物 與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。（原核生物的 RNA、真核生物的 rRNA和 tRNA不具有 PolyA尾巴。 隨機引物 適用于長的或具有發(fā)卡結構的 RNA。 基因特異性引物（ GSP） 對于逆轉錄步驟是特異性最好的引物。因為其較高的特異性， oligo(dT)一般不需要對 RNA和引物的比例及 poly(A)+選擇進行優(yōu)化。 Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。末端序列及從帶有 二級結構區(qū)域 或帶有逆轉錄酶不能復制的 終止位點 的 RNA模板獲得 cDNA。 C RNA在高于 65℃ 時開始水解，對于 ≤ 1kb的 RNA第一鏈合成溫度可以為 70℃ ，對于＞ 1kb的 RNA則需要＜ 65℃ 。 C 37176。 C RNA在高于 65℃
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