熒光定量pcr-wenkub
2022-08-29 14:01:17 本頁面
【正文】 可以在這個階段進行定量分析 。 （陳旭等， 2022） 二、 熒光定量 PCR概述 （ 1）在熒光定量 PCR 反應(yīng)中， 引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進行， PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。 熒光定量 PCR 2022801188 劉 兵 目錄 一、背景知識 二、熒光定量 PCR概述 三、熒光定量 PCR的主要原理 四、熒光定量 PCR定量的理論依據(jù) 五、熒光定量 PCR定量的理論模式 六、熒光定量 PCR的分類 七、傳統(tǒng)的定量 PCR的難點 八、熒光定量 PCR的優(yōu)點 九、怎樣設(shè)計熒光定量 PCR實驗方案 十、熒光定量 PCR技術(shù)在科研中的應(yīng)用 一、背景知識 1985 年，美國 PerkinElmer Cetus 公司人類遺傳研究室 Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)（ Polymerase chain reaction, PCR），使人們夢寐以求的體外無限擴增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化。（朱捷等， 2022） （ 3）、 為了便于對所檢測樣本進行比較，在熒光定量 PCR 反應(yīng)的指數(shù)期，需要設(shè)定一定熒光信號的閾值，一般這個閾值是以 PCR反應(yīng)的前15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本地信號， 熒光閾值的缺省設(shè)置是 3~15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。當(dāng)信號增強到熒光閾值時， Ct 值被記錄下來 。（趙煥英等，2022） （ 5）、起始拷貝數(shù)越多， Ct 值越小。 （ 2）、理想的擴增結(jié)果： Y=X 2n 其中 Y代表擴增產(chǎn)物量， X代表 PCR反應(yīng)體系中的原始模板數(shù)， n為擴增次數(shù)。 （ 3）、設(shè)定 PCR到達指數(shù)擴增期時，產(chǎn)生一定的熒光（熒光依賴于某一循環(huán)擴增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù) K，大約在 1010左右）高于背景為儀器所識別，此時的循環(huán)數(shù)為 CP（ crossing point），也就是 K=T0 （ 1+E） CP，取對數(shù)得： lgK=lgT0+CP*lg（ 1+E） CP=1/lg（ 1+E） *lgT0+lgK/lg（ 1+E） 由于對一特定的 PCR而言， E與 K均為常數(shù)，故上式為循環(huán)數(shù) CP對原始模板拷貝數(shù)的對數(shù) lgT0一次方程，其標(biāo)準(zhǔn)形式 y=kx+b，該直線的斜率為 1/lg（ 1+E），在橫坐標(biāo)上的截距為 lgK/lg（ 1+E），依據(jù)此作 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。 熒光定量 PCR使用外標(biāo)定量的原因： A、內(nèi)標(biāo)對實時熒光定量 PCR的影響 若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則 PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。 （ 2） Ct值與起始模板的線性關(guān)系 由于 Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量 PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。其與雙鏈 DNA結(jié)合后，熒光大大增強。 SYBR Green I 的缺點： 由于 SYBR Green I沒有特異性，不能識別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光，對 PCR反應(yīng)中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光，通常本底較高，所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。已有文獻報道在 PCR反應(yīng)體系中加入 LC Green TM I, 使用一對引物 , 一個不作標(biāo)記的探針 , 結(jié)合常規(guī)融解曲線或僅使用一對引物 , PCR 結(jié)束后通過分析融解曲線的形狀和融解溫度 (Tm值
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