實時熒光pcr技術(shù)(已修改)
2025-08-27 21:50 本頁面
【正文】 實時熒光定量 PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 講 座 提 綱 ? 實時熒光定量 PCR原理 ? 實時熒光定量 PCR的幾種方法介紹 ? 實時熒光定量 原理實時熒光定量 的幾種方法介紹實時熒光定量技術(shù)的應(yīng)用 實時熒光定量 PCR定義 在 PCR反應(yīng)體系中加入 熒光基團 ，利用熒光信號累積 實時監(jiān)測 整個 PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 實時熒光定量 PCR 原理 實時原理 常 規(guī) PCR技術(shù)： 對 PCR擴增反應(yīng)的 終點產(chǎn)物 進行定量和定性分析 無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測 實時定量 PCR技術(shù)： 利用 熒光信號的變化實時檢測 PCR擴增反應(yīng)中 每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化 ，通過 Ct值和標準曲線的分析對 起始模板 進行定量分析 實時熒光定量 PCR原理定量原理 介紹三個概念： 擴增曲線、熒光閾值、 Ct值 如何對起始模板定量？ 通過 Ct值和標準曲線對 起始模板 進行定量分析 實時熒光定量 PCR 原理 擴增曲線 擴增曲線圖： 橫坐標： 擴增循環(huán)數(shù)（ Cycle）； 縱坐標： 熒光強度 每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集 熒光基團 熒光檢測元件 實時熒光定量 PCR 原理 熒光 閾 值 熒光信號 閾 值 （ threshold ） ： ? 前 15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（ baseline），即 樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值 ? 熒光域值的缺省設(shè)置是 3～ 15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10倍 ? 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于 ? 真正的信號 :熒光信號超過域值 實時熒光定量 PCR 原理 Ct值 Ct值的定義 ： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增 循環(huán)次數(shù) C(t) value 實時熒光定量 PCR 原理 Ct值的重現(xiàn)性 橫軸： PCR反映循環(huán)數(shù) 縱軸：熒光信號量 Ct值的特點 ： ?相同模板進行 96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定； ? Ct值則極具重現(xiàn)性 實時熒光定量 PCR 原理 定量原理 ?理想的 PCR反應(yīng)： ? X=X0*2n ?非理想的 PCR反應(yīng)： ? X=X0 (1+Ex)n ? n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) ? X：第 n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 ? X0：初始模板量 ? E
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