實(shí)時熒光pcr技術(shù)-在線瀏覽
2024-09-25 21:50本頁面
【正文】 每擴(kuò)增一條 DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測熒光 TaqMan 法 PCR反應(yīng)的建立 引物、探針的設(shè)計： 探針 Tm為 6870℃ ， 30 bp, 5’不能有 G， G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段 400 bp，引物 Tm為 5960℃ 反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為： 94 ℃ ， 1020S 60℃ ， 3060S（ Taq酶 5′→3′ 外切核酸酶活性在 60℃ 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 ℃ ， 45 S， 優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小 Ct值，信號 /背景比值的最大值 引物濃度： 50900nM 探針濃度： 50250nM 其他與常規(guī) PCR相同 TaqMan法 優(yōu)缺點(diǎn) ? 對目標(biāo)序列的高特異性 陰性結(jié)果確定 ? 設(shè)計相對簡單 與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ) ?重復(fù)性比較好 優(yōu) 點(diǎn) ? 只適合一個特定的目標(biāo) ? 委托公司標(biāo)記，價格較高 ? 不易找到本底低的探針 缺 點(diǎn) 實(shí)時熒光定量 PCR 方法 3 Molecular beacon 法 (分子信標(biāo) ) ?標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 ?環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ) ?莖由互補(bǔ)配對序列組成 環(huán) 莖 熒光素 淬滅劑 發(fā)夾型雜交探針 Molecular beacon (分子信標(biāo) ) 工作原理 ? 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET） ? 探針與 DNA雜交時產(chǎn)生熒光 變性過程：產(chǎn)生非特異性熒光 延伸過程：不產(chǎn)生熒光 退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號 Molecular beacon (分子信標(biāo) ) 應(yīng)用范圍 ? 起始模板的定量 ? 基因型分析 ? 產(chǎn)物鑒定 ? SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析 Molecular beacon (分子信標(biāo) ) 優(yōu)缺點(diǎn) ?高特異性： 對目標(biāo)序列 檢測 SNP最靈敏的試劑之一 ?熒光背景低 優(yōu) 點(diǎn) ? 只能用于一個特定目標(biāo) ? 設(shè)計困難 ? 價格比較高 缺 點(diǎn) 講 座 提 綱 ? 實(shí)時熒光定量 PCR原理 ? 實(shí)時熒光定量 PCR的幾種方法介紹 ? 實(shí)時熒光定量 PCR實(shí)驗設(shè)計及應(yīng)用 實(shí)時熒光定量 原理實(shí)時熒光定量 的幾種方法介紹實(shí)時熒光定量 實(shí)驗設(shè)計及應(yīng)用實(shí)時熒光定量 PCR
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