熒光定量pcr的原理及應(yīng)用-在線瀏覽
2025-07-15 14:14本頁面
【正文】 光信號累積，實(shí)時監(jiān)測整個 PCR進(jìn)程，最后通過參照標(biāo)準(zhǔn)曲線對反應(yīng)體系中未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 實(shí)時熒光定量 PCR中的三個概念 ? 增長曲線 (primary curve) ? 熒光閾值（ threshold) ? CT 值 (Cycle Threshold) 增長曲線 反映熒光強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)的對應(yīng)關(guān)系 Cycle Fluorescence 域值 ： PCR擴(kuò)增信號進(jìn)入相對穩(wěn)定對數(shù)增長期時的熒光值。 Ct值與起始模板的關(guān)系 每個模板的 CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。 一般正常的 CT值范圍在 1535之間，過大和過小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。 I 優(yōu)點(diǎn)： ?使用方便，可以應(yīng)用于不同的模板 ?靈敏，便宜 缺點(diǎn)： ?與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，但可以通過熔解曲線進(jìn)行辨別 熔解溫度 (Tm值 ) ? Tm值： 50%DNA變成單鏈時的溫度，此溫度與雙鏈 DNA的長度、 GC含量有關(guān)，可部分代表序列的特異性。M （一般略低于 PCR引物量） ? 熒光物質(zhì)濃度：按說明書操作，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化 ? 加樣準(zhǔn)確性：避免微小加樣 熒光定量 PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線 ? 模板 ? Plasmid DNA 目的片段在 Plasmid DNA 中很易被擴(kuò)增，可以適當(dāng)稀釋 ? Total DNA 目的片段在 Total DNA中豐
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