熒光定量pcr的原理及應(yīng)用(已改無錯字)
2023-06-24 14:14:55 本頁面
【正文】 ? Plasmid DNA 目的片段在 Plasmid DNA 中很易被擴(kuò)增，可以適當(dāng)稀釋 ? Total DNA 目的片段在 Total DNA中豐度相對較低，因此 Total DNA量要略高于Plasmid DNA ? cDNA 以 cDNA為模板時一般將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液稀釋 10~50倍后作模板 熒光定量 PCR實驗技術(shù)路線 ? 熒光定量 PCR反應(yīng)靈敏，微小差異都能被反映，實驗中要避免核酸污染，尤其是避免 PCR產(chǎn)物污染。 ? 試劑反復(fù)凍融對實驗也有影響，各組分采用少量分裝保存 ? 低濃度模板反復(fù)凍融容易降解，少量分裝保存 定量方法 ? 絕對定量 ? 相對定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線 ? 由系列稀釋的已知濃度的樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線 ? 計算待測樣品的濃度 log N0 = Ct logE +logN 絕對定量 —— 未知濃度的樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較 絕對定量 ? 標(biāo)準(zhǔn)品：含有目的片段的濃度已知的核酸 ? 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，一般選取 45個點（多于 5個更好），被選點的模板濃度范圍要包括待測樣本濃度 相對定量 —— 在一定樣本中靶基因相對于另一參照樣本的量的變化 ? 只需要了解相對于參照樣本目的基因的表達(dá)量的變化量，而不需要確切的知道基因的表達(dá)量具體是多少，采用相對定量即可。 ? 比較的依據(jù)是實驗時不同樣本的總核酸模板一致 ? 用表達(dá)量基本恒定的看家基因作為內(nèi)參照來體現(xiàn)上樣
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