熒光定量pcr技術(shù)講座-在線瀏覽
2025-06-20 18:46本頁面
【正文】 ? SYBR Green I 特異性熒光標(biāo)記： ?水解探針： TaqMan ?非水解探針： Molecular beacon R Q Reporter Quencher R Q 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG Emission Excitation ? SYBR Green I 是一種與雙鏈 DNA小溝結(jié)合的熒光染料。 ? 熒光信號的強度與反應(yīng)體系中所有雙鏈 DNA分子成正比。 染料法與探針法 對比 探針法 ? 特異性高 與探針與特異靶序列結(jié)合 ? 對模板有選擇性 可進(jìn)行多重 PCR反應(yīng) ? 成本高 不同靶基因需要合成不同探針 染料法 ? 通用性好 對 DNA模板沒有選擇性 ? 使用方便，成本低 僅需設(shè)計兩個引物 ? 有假陽性現(xiàn)象 通過融解曲線判斷 Realtime PCR 應(yīng)用 ? 基因表達(dá)分析 相對定量： 基因表達(dá)量的差異 絕對定量： 樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克） ? 基因型分析 SNP檢測 等位基因檢測 甲基化檢測 基因表達(dá)分析檢測 test sample 處理樣本 target gene 目的基因 reference gene 內(nèi)參基因 total RNA cDNA calibrator sample 對照樣本 target gene 目的基因 reference gene 內(nèi)參基因 qPCR 以各自樣本中內(nèi)參基因為標(biāo)桿， 比較兩樣本中目的基因的相對豐度。 對樣本初始濃度差異進(jìn)行均一化校正。 Housekeeping Gene 康為產(chǎn)品 ?不同豐度： 高豐度 ACTB、 GAPDH 中等豐度 beta2M 低豐度 HPRT1 ?不同物種： 人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚、甘蔗 等 基因表達(dá)分析檢測 ? 樣本處理與 RNA提取 – cDNA – qPCR ? 內(nèi)參基因 (housekeeping gene)選擇 樣本處理與 RNA提取 ? 外界刺激 – 10分鐘 – 可檢測的表達(dá)改變 ? 樣品離開定義環(huán)境 – 2分鐘內(nèi) –固定、裂解細(xì)胞 – RNA樣本保存液 – Trizol – 超純 RNA提取試劑盒 ? RNA的評價與鑒定 完整性 純度 ? 小心 DNA污染！ 使用 DNaseⅠ 引物設(shè)計 以 RNA作 PCR陰性對照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RTqPCR一步法還是兩步法？ 兩步法： 步驟多但靈活多樣。 推薦：工作的初期階段，以及單個樣本多個靶基因檢測。每次只能做一個基因。 逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄引物選擇 – 下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？ – Abundant RNA的干擾： mRNA or total RNA？ – 檢測靈敏度是否足夠？ 逆轉(zhuǎn)錄酶 – SuperRT 逆轉(zhuǎn)錄酶（ RNase H） – HiFiMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（ RNase H） 引物 特異性 反應(yīng)效率 Oligo dT 中 低 Random hexmer 低 中 Specific primer 高
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