熒光定量pcr技術講座(編輯修改稿)
2025-05-30 18:46 本頁面
【文章內容簡介】 SYBR Green I 工作原理 Taqman 工作原理 在退火過程中，探針與靶序列結合 探針被 Taq酶的 5’ 3’ 外切酶活性剪切成片斷 游離報告基團發(fā)出熒光 在延伸過程中，探針部分與靶序列分離 熒光信號強度與結合探針的 DNA分子成正比。 染料法與探針法 對比 探針法 ? 特異性高 與探針與特異靶序列結合 ? 對模板有選擇性 可進行多重 PCR反應 ? 成本高 不同靶基因需要合成不同探針 染料法 ? 通用性好 對 DNA模板沒有選擇性 ? 使用方便，成本低 僅需設計兩個引物 ? 有假陽性現(xiàn)象 通過融解曲線判斷 Realtime PCR 應用 ? 基因表達分析 相對定量： 基因表達量的差異 絕對定量： 樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克） ? 基因型分析 SNP檢測 等位基因檢測 甲基化檢測 基因表達分析檢測 test sample 處理樣本 target gene 目的基因 reference gene 內參基因 total RNA cDNA calibrator sample 對照樣本 target gene 目的基因 reference gene 內參基因 qPCR 以各自樣本中內參基因為標桿， 比較兩樣本中目的基因的相對豐度。 數(shù)據(jù)分析 qPCR cDNA total RNA 內參基因的選擇 特點 選擇內參基因 內參基因 betaactin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等 文獻檢索 實驗篩選 選擇多個備選內參基因，以備選內參基因的幾何平均數(shù)作為均一化標準 內參基因Housekeeping Gene RNA抽提、反轉錄為 cDNA的效率不同，用于定量分析的樣本初始濃度不同。 對樣本初始濃度差異進行均一化校正。 不同環(huán)境，不同器官、組織、細胞類型之間，表達量相對恒定。 Housekeeping Gene 康為產(chǎn)品 ?不同豐度： 高豐度 ACTB、 GAPDH 中等豐度 beta2M 低豐度 HPRT1 ?不同物種： 人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚、甘蔗 等 基因表達分析檢測 ? 樣本處理與 RNA提取 – cDNA – qPCR ? 內參基因 (housekeeping gene)選擇 樣本處理與 RNA提取 ? 外界刺激 – 10分鐘 – 可檢測的表達改變 ? 樣品離開定義環(huán)境 – 2分鐘內 –固定、裂解細胞 – RNA樣本保存液 – Trizol – 超純 RNA提取試劑盒 ? RNA的評價與鑒定 完整性 純度 ? 小心 DNA污染！ 使用 DNaseⅠ 引物設計 以 RNA作 PCR陰性對照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RTqPCR一步法還是兩步法？ 兩步法： 步驟多但靈活多樣。 cDNA可長期保留，檢測多個基因，便于反應條件的優(yōu)化。 推薦：工作的初期階段，以及單個樣本多個靶基因檢測。 一步法： 簡單、靈敏度高，有效減少實驗操作誤差和污染。每次只能做一個基因。 推薦：工作的成熟
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