【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcattttt CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGCGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 目的基因序列獲得 引物設(shè)計(jì) 序列分析 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ SNP 3’ 末端的 T 3bp互補(bǔ) 目的基因序列獲得 引物設(shè)計(jì) 序列分析 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ 物種選擇 參考數(shù)據(jù)庫 ? RefSeqrna WordSize ? 7 目的基因序列獲得 引物設(shè)計(jì) 序列分析 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC 5’ 5’ 3’ 目的基因序列獲得 引物設(shè)計(jì) 序列分析 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) 目的基因 3’ Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ Probe 長(zhǎng)度 ★★ 2024bp Tm 值 ★★★ 探針的 Tm比引物高 810℃ 序 列 ★ 目的序列 GC含量相對(duì)較高的區(qū)域設(shè)計(jì) 整體上堿基不能過偏 個(gè)別部分避免 GC rich或 AT rich (特別是 3’端 )避免 T/C連續(xù)， A/C連續(xù) ) 5’末端序列 ★ 探針 5’末端的第一個(gè)堿基不能是 G 互 補(bǔ) 性 ★★★ Probe內(nèi)部或 Probe與兩條引物之間避免 3base以上的互補(bǔ)序列 特 異 性 ★★★ BLAST檢索確認(rèn) Probe特異性 Real Time PCR用 TaqMan探針設(shè)計(jì)原則 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) ★ 號(hào)表示重要程度， ★ 號(hào)越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計(jì)時(shí)要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 3’淬滅基團(tuán) 淬滅基團(tuán)性質(zhì) 建議使用的 5’報(bào)告基團(tuán) TAMRA 熒光物質(zhì) FAM, HEX, TET, JOE等 Eclipse 非熒光物質(zhì) FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等 TaqMan探針熒光標(biāo)記物選擇 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ 引物反應(yīng)性確認(rèn) 線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn) 檢測(cè)靈敏度確認(rèn) No template control確認(rèn) PCR擴(kuò)增效率（ E） : 35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果 如果采用 SYBR檢測(cè)方法， 30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增 30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生 相關(guān)系數(shù)（ r2）：大于 生物秀 — 專心做生物！ PCR條件優(yōu)化順序 標(biāo)準(zhǔn) Protcol 95℃ 10sec. 60℃ 20sec. (Primer 終濃度 200nM) B. 有非特異性擴(kuò)增時(shí) ? 提高退火溫度 ? 縮短退火 、 延伸時(shí)間 ? 降低引物濃度 A. 擴(kuò)增效率低時(shí) ? 延長(zhǎng)退火 、 延伸時(shí)間 ? 提高退火 、 延伸溫度 ? 改為三步 PCR,降低退火溫度 ? 提高引物濃度 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 融解曲線分析 絕對(duì)定量和相對(duì)定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ 基線平整 Negative control為水平線 指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大 平臺(tái)區(qū)匯于一起 線性范圍寬 理想的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)品的種類 DNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品 基因組 DNA 質(zhì)粒 PCR產(chǎn)物 RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品 Total RNA amp。 cDNA 體外轉(zhuǎn)錄 RNA PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒 生物秀 — 專心做生物！ 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建用引物區(qū) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物設(shè)計(jì) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 AGTACCTAGATCCTAG AGTACCTAGATCCTAG 生物秀 — 專心做生物！ 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 基因組 DNA PCR 目的基因克隆 質(zhì)粒提取， OD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至 105101 copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。 目的基因 目的基因 目的基因 質(zhì)粒 生物秀 — 專心做生物！ …… …… 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建用引物區(qū) 藍(lán)色 部分 T7啟動(dòng)子和 Poly(T) RNA標(biāo)準(zhǔn)品引物設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ RNA純化后，測(cè) OD定量。將 RNA梯度稀釋至 105101 copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。 體外轉(zhuǎn)錄 RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 T7 RNA polymerase 體外轉(zhuǎn)錄 RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT???T PCR產(chǎn)物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA???A AAAA???A 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 擴(kuò)增曲線 106 105 104 103 102 101 標(biāo)準(zhǔn)曲線 106 105 104 103 102 101 ? 標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇： 5～ 6個(gè)梯度 ? 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇： 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為 10 生物秀 — 專心做生物！ 理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線 相關(guān)系數(shù)（ r2）：大于 ，越接近 1，結(jié)果可信度越高。 擴(kuò)增效率（ E）： , 越接近 1，越理想。 相關(guān)系數(shù) 斜率 擴(kuò)增效率（ E）計(jì)算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線 X軸表示起始模板濃度（ log10)， Y軸表示 Ct值時(shí) E=101/a1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 X軸表示 Ct值， Y軸表示起始模板濃度（ log10) E=10a1 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 ? 融解曲線分析 ? 絕對(duì)定量和相對(duì)定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ Tm值是指雙鏈 DNA分子解鏈一半時(shí)的溫度。 融解曲線分析 SYBR Green I法進(jìn)行檢出時(shí)， 要根據(jù)融解曲線確認(rèn) PCR產(chǎn)物的特異性。 生物秀 — 專心做生物！ 特異性產(chǎn)物 非特異產(chǎn)物 引物二聚體 對(duì) PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析 融解曲線分析 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 融解曲線分析 絕對(duì)定量和相對(duì)定量解析方法 Real Time PCR 解析方法 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 絕對(duì)定量解析方法 引物設(shè)計(jì) 標(biāo)準(zhǔn)品制備 Real Time PCR反應(yīng) 數(shù)據(jù)分析 流 程 生物秀 — 專心做生物！ 絕對(duì)定量解析方法 通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測(cè)及轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。 105 104 103 101 擴(kuò)增曲線圖 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 檢測(cè)樣品 檢測(cè)樣品 102 以上條件不可能同時(shí)得到滿足，必須用內(nèi)對(duì)照基因（管家基因）校正， 進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。 理論上目的基因表達(dá)量分析條件