【文章內容簡介】 cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcattttt CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGCGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 目的基因序列獲得 引物設計 序列分析 特異性確認 基因組序列確認 目的基因 Real Time PCR引物及探針設計 Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGCC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ SNP 3’ 末端的 T 3bp互補 目的基因序列獲得 引物設計 序列分析 特異性確認 基因組序列確認 目的基因 Real Time PCR引物及探針設計 Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ 物種選擇 參考數(shù)據(jù)庫 ? RefSeqrna WordSize ? 7 目的基因序列獲得 引物設計 序列分析 特異性確認 基因組序列確認 目的基因 Real Time PCR引物及探針設計 Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC 5’ 5’ 3’ 目的基因序列獲得 引物設計 序列分析 特異性確認 基因組序列確認 目的基因 3’ Real Time PCR引物及探針設計 Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ Probe 長度 ★★ 2024bp Tm 值 ★★★ 探針的 Tm比引物高 810℃ 序 列 ★ 目的序列 GC含量相對較高的區(qū)域設計 整體上堿基不能過偏 個別部分避免 GC rich或 AT rich (特別是 3’端 )避免 T/C連續(xù)， A/C連續(xù) ) 5’末端序列 ★ 探針 5’末端的第一個堿基不能是 G 互 補 性 ★★★ Probe內部或 Probe與兩條引物之間避免 3base以上的互補序列 特 異 性 ★★★ BLAST檢索確認 Probe特異性 Real Time PCR用 TaqMan探針設計原則 Real Time PCR引物及探針設計 ★ 號表示重要程度， ★ 號越多，表示該參數(shù)越重要，設計時要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 3’淬滅基團 淬滅基團性質 建議使用的 5’報告基團 TAMRA 熒光物質 FAM, HEX, TET, JOE等 Eclipse 非熒光物質 FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等 TaqMan探針熒光標記物選擇 Real Time PCR引物及探針設計 生物秀 — 專心做生物！ 引物反應性確認 線性關系、擴增效率確認 檢測靈敏度確認 No template control確認 PCR擴增效率（ E） : 35Cycles內可得到好的定量結果 如果采用 SYBR檢測方法， 30Cycles內無非特異性產物擴增 30Cycles內無引物二聚體產生 相關系數(shù)（ r2）：大于 生物秀 — 專心做生物！ PCR條件優(yōu)化順序 標準 Protcol 95℃ 10sec. 60℃ 20sec. (Primer 終濃度 200nM) B. 有非特異性擴增時 ? 提高退火溫度 ? 縮短退火 、 延伸時間 ? 降低引物濃度 A. 擴增效率低時 ? 延長退火 、 延伸時間 ? 提高退火 、 延伸溫度 ? 改為三步 PCR,降低退火溫度 ? 提高引物濃度 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎知識 Real Time PCR 實驗方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應用實例 Real Time PCR 相關試劑與服務 主要內容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 標準曲線分析 融解曲線分析 絕對定量和相對定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ 基線平整 Negative control為水平線 指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大 平臺區(qū)匯于一起 線性范圍寬 理想的標準品擴增曲線 生物秀 — 專心做生物！ 標準品的種類 DNA樣品定量標準品 基因組 DNA 質粒 PCR產物 RNA樣品定量標準品 Total RNA amp。 cDNA 體外轉錄 RNA PCR產物或質粒 生物秀 — 專心做生物！ 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標準品構建用引物區(qū) 質粒標準品引物設計 質粒標準品構建 AGTACCTAGATCCTAG AGTACCTAGATCCTAG 生物秀 — 專心做生物！ 質粒標準品構建流程 基因組 DNA PCR 目的基因克隆 質粒提取， OD值定量。將質粒梯度稀釋至 105101 copies/ul，作為標準品。 目的基因 目的基因 目的基因 質粒 生物秀 — 專心做生物！ …… …… 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標準品構建用引物區(qū) 藍色 部分 T7啟動子和 Poly(T) RNA標準品引物設計 生物秀 — 專心做生物！ RNA純化后，測 OD定量。將 RNA梯度稀釋至 105101 copies/ul，作為標準品。 體外轉錄 RNA標準品構建流程 T7 RNA polymerase 體外轉錄 RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT???T PCR產物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA???A AAAA???A 生物秀 — 專心做生物！ 標準曲線制作 擴增曲線 106 105 104 103 102 101 標準曲線 106 105 104 103 102 101 ? 標準品梯度的選擇： 5～ 6個梯度 ? 標準品稀釋倍數(shù)的選擇： 標準品稀釋倍數(shù)通常為 10 生物秀 — 專心做生物！ 理想的標準曲線 相關系數(shù)（ r2）：大于 ，越接近 1，結果可信度越高。 擴增效率（ E）： , 越接近 1，越理想。 相關系數(shù) 斜率 擴增效率（ E）計算方法 標準曲線 X軸表示起始模板濃度（ log10)， Y軸表示 Ct值時 E=101/a1 標準曲線 X軸表示 Ct值， Y軸表示起始模板濃度（ log10) E=10a1 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 ? 標準曲線分析 ? 融解曲線分析 ? 絕對定量和相對定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ Tm值是指雙鏈 DNA分子解鏈一半時的溫度。 融解曲線分析 SYBR Green I法進行檢出時， 要根據(jù)融解曲線確認 PCR產物的特異性。 生物秀 — 專心做生物！ 特異性產物 非特異產物 引物二聚體 對 PCR產物特異性進行分析 融解曲線分析 生物秀 — 專心做生物！ 標準曲線分析 融解曲線分析 絕對定量和相對定量解析方法 Real Time PCR 解析方法 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 絕對定量解析方法 引物設計 標準品制備 Real Time PCR反應 數(shù)據(jù)分析 流 程 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量解析方法 通過制作標準曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應用于病毒、細菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉基因食品的檢測。 105 104 103 101 擴增曲線圖 標準曲線圖 檢測樣品 檢測樣品 102 以上條件不可能同時得到滿足，必須用內對照基因（管家基因）校正， 進行相對表達量分析。 理論上目的基因表達量分析條件