【正文】 物！ 同一個(gè)樣品重復(fù) 96次 PCR的擴(kuò)增曲線 Real Time PCR 原理 Ct值 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR擴(kuò)增過(guò)程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。（ Real Time PCR） 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 生物秀 — 專心做生物！ 主要內(nèi)容 Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測(cè)方法 Real Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 差異顯示結(jié)果驗(yàn)證 定性分析 絕對(duì)定量 相對(duì)定量 病毒和病原菌檢測(cè) 基因芯片結(jié)果驗(yàn)證 siRNA效果確認(rèn) mRNA表達(dá)量分析 Real Time PCR 用途 操作簡(jiǎn)單，無(wú)需電泳，檢測(cè)快速，降低污染幾率， 適用于大量樣品檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高； 可以在寬廣范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 生物品種鑒定 病毒和病原菌定量分析 導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析 GMO定量檢測(cè) SNP解析 激發(fā)光 發(fā)射光 Ct值 Real Time PCR 原理 使用 Real Time PCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。 ( C代表 Cycle， t代表 threshold） Ct值概念 閾值：在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上 設(shè)定的熒光檢出界限。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測(cè)方法 Real Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR檢測(cè)方法 ? 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) ? 熒光探針?lè)? TaqMan probe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpions probe Amplifluor probe 生物秀 — 專心做生物！ SYBR Green I是一種結(jié)合于所有 dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。 TaqMan Probe法作用機(jī)理 TaqMan Probe 法作用機(jī)理示意圖 熱變性 引物和探針與模板退火 延伸反應(yīng) 探針 報(bào)告基團(tuán) 淬滅基團(tuán) 探針 DNA聚合酶 引物 R R R R 生物秀 — 專心做生物！ Cycling probe為一寡核苷酸， 5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán) (Reporter)， 3’端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)(Quencher)，寡核苷酸為 DNA/RNA雜合體。 ◆缺點(diǎn)：引物要求高（要求特異性擴(kuò)增）、不能進(jìn)行多重 PCR。 ◆缺點(diǎn)：需要設(shè)計(jì)特異性探針，成本高、有時(shí)設(shè)計(jì)困難。 但是 ??? 使用 SYBR Green I 進(jìn)行檢測(cè)的問(wèn)題點(diǎn) ● SYBR Green I與雙鏈 DNA進(jìn)行結(jié)合后散収熒光，因此如果反 應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增，非特異性 DNA也將同時(shí)被檢測(cè)， 從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ GATC CTAG GATC CTAG 使用 SYBR Green I 進(jìn)行定量 PCR 的 Key Point Primer： 設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增，是使用 SYBR Green I 進(jìn)行定量 PCR 的 Key Point。 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測(cè)方法 Real Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 生物秀 — 專心做生物！ 生產(chǎn)廠商 儀器名稱 TaKaRa公司 TP800 Applied Biosystems公司 ABI PRISM 7700、 7000、 7300、 7900HT、 7500Fast Roche公司 LightCycler174。 480 Cepheid公司 Smart Cycler、 Smart Cycler II、 Smart Cycler 174。、 Mx3000P174。 480 Rotorgene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINEGENE FQD66A ABI PRISM 7500 iQ5 RealTime PCR Detection System TaKaRa TP800 各公司 Real Time PCR檢測(cè)系統(tǒng)比較 儀器名稱 反應(yīng)孔數(shù) 反應(yīng)孔間 獨(dú)立性 檢出通道 升降溫速度 Tube ROX熒光 校正功能 TaKaRa TP800 96 無(wú) 25 快 Tube 無(wú) ABI7000 96 無(wú) 4 快、慢兩種 8聯(lián)管、 專用 Cap 有 ABI7500 Fast 5 快 Light 32 無(wú) 6 快 專用毛細(xì)玻璃管 無(wú) Light Cycler 480 96 or 384 5 快 專用板 Smart Cycler 16 (6 16 ) 有 4 快 專用、塑料＋石英 無(wú) RotorGene 3000 36 () 72 () 無(wú) 4 慢 Tube, Tube 無(wú) MiniOpticon 48 無(wú) 2 快 Tube 無(wú) iQ5 RealTime PCR Detection System 96 無(wú) 5 快 Tube 無(wú) LINEGENE FQD66A 66 無(wú) 4 快 Tube 無(wú) Mx3000P174。 Real Time PCR反應(yīng) ? 以 DNA為起始實(shí)驗(yàn)材料時(shí)。通常 mRNA表達(dá)量分析最適。 One Step RTPCR只能使用Gene specific Primer， 不適用于 mRNA表達(dá)量分析等復(fù)數(shù)基因的檢出。A 5’ 3’ 目的片段 R F 1,500base Oligo dT Primer 生物秀 — 專心做生物！ mRNA Primer F Primer R 目的片段 RTPCR 外顯子 1 基因組 DNA PCR 外顯子 2 外顯子 3 外顯子 1 外顯子 2 外顯子 3 內(nèi)含子 2 內(nèi)含子 1 Primer F Primer R 目的片段 Total RNA中 Genomic DNA混入的對(duì)策 此種情況必須采用 DNase I處理，去除基因組 DNA 生物秀 — 專心做生物！ mRNA 基因組 DNA 目的片段 RTPCR 外顯子 1 外顯子 2 外顯子 3 Primer F Primer R Primer F Primer R PCR 長(zhǎng)的擴(kuò)增片段 無(wú)擴(kuò)增片段 外顯子 1 外顯子 2 外顯子 3 內(nèi)含子 2 內(nèi)含子 1 Total RNA中 Genomic DNA混入的對(duì)策 引物設(shè)計(jì)可以避免基因組 DNA來(lái)源的 Template擴(kuò)增 生物秀 — 專心做生物！ 目的是獲得目的基因，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。 Real Time PCR用引物與普通 PCR引物設(shè)計(jì)要求不同 = 對(duì)引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格 普通 PCR引物 Real Time PCR引物 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 擴(kuò)增片段大小 ★ 80150bp(盡量限制在 300bp以內(nèi) ) Primer長(zhǎng)度 ★ 1725base GC含量 ★ 4060%(最好 4555%) Tm值 ★ ★ ★ 兩條引物的 Tm值盡量接近，引用專用軟件計(jì)算 Tm值 序列 ★ 整體上堿基不能過(guò)偏 個(gè)別部分避免 GC rich或 AT rich(特別是 3’端 ) 避免 T/C連續(xù)， A/G連續(xù) 3’末端序列 ★ 3’末端避免 GC rich或 AT rich 3’末端堿基最好為 G 或 C 3’末端堿基盡量避免為 T 互補(bǔ)性 ★ ★ ★ 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免 3base以上的互補(bǔ)序列 引物 3’末端避免 2base以上的互補(bǔ)序列 特異性 ★ ★ ★ 使用 BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 RTPCR用引物 ★★ 盡量在 Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組 DNA擴(kuò)增 Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)原則 ★ 號(hào)表示重要程度， ★ 號(hào)越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計(jì)時(shí)要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因序列獲得 好的引物 需要尋找好的參照序列 引物設(shè)計(jì) 分析序列 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) RefSeq序列 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ （ 通過(guò) NCBI獲得參考序列和相關(guān)情報(bào)。 序列可信度高，信息量大 NCBI: The National Center for Biotechnology Information NM_008777 RefSeq 評(píng)價(jià) Pah Pah Pah Pah X51942 BC013458 BI330290 BF789560 X51942 BC013458 BI330290 BF789560 Pah Pah GenBank Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ NCBI提供目的基因相關(guān)信息 （ 基因名 、 染色體上的位置 、 Accession、表 現(xiàn) 型、 文獻(xiàn)索引 、 同源性等其他數(shù)據(jù)庫(kù)以及功能 、 pass way、 蛋白質(zhì)圖譜等 ） 基因詞典 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15APR2022 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_008777 VERSION GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1..1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48..1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding [goid 0005506] /protein_id= /db_xref=GI:6679203 /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc