熒光定量pcr的原理及臨床應(yīng)用2學(xué)生講課hcmv-展示頁
2025-01-15 08:24本頁面
【正文】 酶 Taq酶同時(shí)具有 5’→ 3’方向核酸聚合酶活性 ，還具有對聚合延伸中遇到與靶序列結(jié)合的核苷酸序列的 5’→ 3’核酸 外切酶活性 。 ? 熒光定量 PCR的擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過程是同時(shí)完成 的，而且在 封閉 的反應(yīng)體系中進(jìn)行，比較安全，易于處理。 ? 熒光定量 PCR通過監(jiān)測熒光值的變化，體現(xiàn)每一個循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，分析結(jié)果為 定量 結(jié)果。 ? 通過 Ct值 和 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 對起始標(biāo)本的模板量進(jìn)行定量分析。 ? 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)于 1996年由美國 Applied Biosystems， ABI公司 推出，實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍。 Taq酶的發(fā)現(xiàn) ? 美國的嗜熱菌研究室在黃石國家公園溫泉中發(fā)現(xiàn)了嗜熱菌 (Thermus aquaticus)株， Cetus公司研究人員從中分離了 Taq DNA聚合酶 ? 特點(diǎn)：①耐高溫： 70℃ 2h 活性 90%， 93℃ 2h 活性 60%， 95℃ 2h 活性 40% ； ②延伸溫度較高 (一般為 72 ℃ )：大大 提高了擴(kuò)增特異性、靈敏性和擴(kuò)增效率 。 ? Klenow酶不耐高溫， 90℃ 加熱后會 變性失活 ，每次循環(huán)結(jié)束都要加入新鮮的酶。溫度一般為 72℃ 左右。溫度一般為 50~60℃ 。溫度一般為 95℃ 左右。 ? 由美國 PE公司遺傳部的 Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)的跨時(shí)代意義， Mullis獲得了 1993年諾貝爾化學(xué)獎。熒光定量 PCR的原理及臨床應(yīng)用 蘇曉霽 如何做一個“ 聰明 ”的實(shí)習(xí)生 ? 實(shí)習(xí)的目的就是對在校所學(xué)的理論知識和實(shí)驗(yàn)技能，在臨床的實(shí)際工作中進(jìn)行實(shí)踐、鞏固和提高。 ? 如何做到： ①實(shí)習(xí)之前要復(fù)習(xí)理論知識和實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容 “ 理論先行 ” ②實(shí)習(xí)過程中要“ 聰明 ” ③做好實(shí)習(xí)筆記，用心思考， 實(shí)習(xí)之外下功夫 如何做一個“聰明”的實(shí)習(xí)生 聰 明 耳：認(rèn)真聽老師的說明和講解 看：仔細(xì)看老師的操作 問：有疑問要多提問，多討論 心：要用心去思考 日月：要每天每月堅(jiān)持做到 內(nèi)容概要 ? PCR的定義和原理 ?熒光定量 PCR的原理和分類 ?熒光定量 PCR結(jié)果的分析 ?熒光定量 PCR在臨床的應(yīng)用 PCR的定義 ? PCR是 Polymerase Chain Reaction的縮寫，中文稱為 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ，由 變性 、 退火 及 延伸 幾步反應(yīng)組成一個周期 ,循環(huán)進(jìn)行 ,可使目的 DNA得以迅速擴(kuò)增。 PCR的原理 ? 變性 ：雙鏈 DNA在高溫下解開成單鏈的過程 。 5’…CCACTGCCTCTC …… CCTGAGCTGTGA…3’ 3’…GGTGACGGAGAG …… GGACTCGACACT…5’ 5’…CCACTGCCTCTC …… CCTGAGCTGTGA…3’ 3’…GGTGACGGAGAG …… GGACTCGACACT…5’ 加熱 PCR的原理 ? 退火 ：溫度下降后，兩條配對的單鏈 DNA重新結(jié)合為雙鏈的過程。 5’…CCACTGCCTCTC …… CCTGAGCTGTGA…3’ 3’…GGTGACGGAGAG ……GGACTCGACACT…5’ CCACTGCCTCTC GGACTCGACACT 5’…CCACTGCCTCTC …… CCTGAGCTGTGA…3’ 3’…GGTGACGGAGAG ……GGACTCGACACT…5’ CCACTGCCTCTC GGACTCGACACT 降溫 PCR的原理 ?
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