熒光定量pcr-展示頁
2025-08-10 17:11本頁面
【正文】 ， 熒光信號逐漸減弱 。 熒光信號強度與反應(yīng)體系中所有雙鏈 DNA分子成 正比 。 ? SYBR Green I只與雙鏈 DNA結(jié)合才能發(fā)出熒光。正常的 CT值范圍在 1830之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。 手動設(shè)置：大于樣本的熒光背景值 手工調(diào)整熒光閾值示意圖 Ct 值 (Cycle Threshold) Ct值 ： 在熒光 PCR擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù) 。 縱坐標(biāo)： Rn（熒光值） 橫坐標(biāo)： cycle number（循環(huán)數(shù)） 線性期 熒光閾值（ threshold） 基線 (baseline)： 一般把熒光 PCR的前 15個循環(huán)信號作為熒光本底信號 ,即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光信號，通過熒光強度的變化監(jiān)測擴增產(chǎn)物量的變化，從而得到擴增曲線圖。熒光定量 PCR 技術(shù)部：張勁松 熒光定量 PCR技術(shù)發(fā)展史 熒光定量 PCR的概念 熒光定量 PCR是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針 ， 對 PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤 ， 實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程 ， 結(jié)合相應(yīng)的軟件對結(jié)果進行分析 ， 計算待測樣品的初始模板量 。 熒光定量 PCR與普通 PCR比較 ? 實時在線監(jiān)控 對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期 ? 降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了 PCR反應(yīng)的特異性 ? 增加定量的精確性 全程監(jiān)控，精確定量 ? 結(jié)果分析更快捷方便， 無需電泳 同一樣品重復(fù) 96次的實驗結(jié)果 普通 PCR 終點檢測： 終點產(chǎn)物量經(jīng)過 PCR放大的 DNA量 不恒定，誤差大 QPCR 起點檢測 ： 具有重現(xiàn)性，誤差小 擴增曲線（ primary curve） 隨著 PCR反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。 PCR的擴增曲線實際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型 曲線 。 熒光閥值 (threshold)： 擴增曲線上人為設(shè)定的一個值 缺省設(shè)置： PCR反應(yīng)前 315個循環(huán)熒光本底信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍 , （機器自動設(shè)置）。 Ct值的特點 ： ?相同模板進行 96次擴增，平臺期 DNA拷貝數(shù)波動很大，但 Ct值相對固定； ?Ct值則極具重現(xiàn)性 起始拷貝數(shù) 越多 ，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就 越少 ， Ct值也就越小 ，反之亦然。 Ct值可以確定初始模板量？ ? 理想的 PCR反應(yīng)： X=X0*2n ? 非理想的 PCR反應(yīng)： X=X0(1+Ex)n n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第 n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0
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