【正文】 從免疫學(xué)水平來檢測HBV感染機體后引起免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相應(yīng)抗原抗體的含量（這個“含量”還不是定量，而只是抗原抗體的“有”或“無”），它實際上測定的是機體感染HBV后免疫應(yīng)答結(jié)果的反映。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb三項陽性稱為“大三陽”， HBsAg、HBeAb、HBcAb三項陽性稱為“小三陽”。其刺激機體產(chǎn)生HBeAb，對HBV感染有一定的保護作用，通常認為HbeAb的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象。HBeAg是Pre C基因（前核基因）的編碼產(chǎn)物，是一種非結(jié)構(gòu)性蛋白，為可溶性蛋白質(zhì)，自肝細胞分泌入血中。HBcAb lgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)。其抗原性較強，能刺激機體產(chǎn)生HBcAb。 HBV病毒顆粒呈球形，具有雙層的衣殼，HBsAg鑲嵌于脂質(zhì)雙層的外衣殼中。HBV攜帶者因無癥狀，不易被察覺，其作為傳染源的危害性比患者更甚。我國人群HBV攜帶率約為10%，是世界上最大的“肝炎大國”。乙型肝炎病毒（HBV） 一 乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染 熒光定量PCR是直接擴增病原體的特異性DNA或cDNA，其結(jié)果反映了標本中DNA或RNA存在的多少，結(jié)果通常用數(shù)字表示， 6. 新的藥物及療法的研究與開發(fā)。 4. 作為新的愈后指標。 2. 評價和考核治療效果。 參考文獻[1] Liva K J, Flood SJA, Marmaro J, et al. Oligonucletides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched prode system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Applic, 1995,4:357362.[2] Holland PM, Abramson RD, Waston R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′to 3′exonuclease activity of the themus aquaticus DNA polymerase. Proc Nat Aca Sci USA,1991,88:72767280[3] Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, et al. Stimutaneous amplification anddetection of specific DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10:413417.一 熒光探針定量PCR定量檢測的意義 PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用就是從檢測鐮狀細胞和β地中海貧血的基因突變開始的。一些病毒致癌作用也與病毒載量有關(guān)，EB病毒載量的FQPCR檢測結(jié)果已被用于鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)和隨訪。用定量逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR方法，一般條件下可檢出10102某種標志物的mRNA，可大大提高檢出率。腫瘤標記物質(zhì)也是腫瘤診斷的熱門研究領(lǐng)域。幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測到原癌基因易位導(dǎo)致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技術(shù)可通過檢測BCR/ABL融合基因的表達確定微量殘余惡性細胞存在的數(shù)量，以此作為治療效果和估計復(fù)發(fā)的危險性的依據(jù)。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)。盡管腫瘤發(fā)病的分子機制尚未完全清楚，但相關(guān)的基因的遺傳學(xué)改變的積累，是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被普遍接受。例如，干擾素治療對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作用。定量PCR研究資料已表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。PCR對病原體的檢測解決了免疫學(xué)檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。 感染性疾病 科學(xué)研究已經(jīng)證明，人類疾病大都直接或間接與基因有關(guān)，臨床實驗醫(yī)學(xué)正進入基因診斷時代。FQPCR通過計算機和分析軟件，使PCR擴增、產(chǎn)物檢測和定量分析一體化，比傳統(tǒng)定性PCR更為簡便和快速，同時也避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物分析中有害物質(zhì)對人體的影響，計算和數(shù)據(jù)處理也有利于科研和臨床資料的保存和分析。FQPCR通過特異性探針雜交信號檢測PCR擴增產(chǎn)物，相當于PCR反應(yīng)過程中自動完成了Southern雜交，進一步提高目的基因檢測的特異性。 熒光探針雜交，進一步提高了特異性FQPCR 技術(shù)已用于單細胞基因診斷，靈敏度已達到極限水平，即檢測單拷貝基因，而傳統(tǒng)PCR是不易做到的。而且，這一條件處于擴增產(chǎn)物指數(shù)積累初期，合成產(chǎn)物所需的dNTP、酶、離子均處于飽和的最佳狀態(tài)，所以FQPCR循環(huán)參數(shù)與起始模板間有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)＞），實現(xiàn)了極為精確的基因定量檢測。為了擴大PCR檢出的靈敏度通常要增加循環(huán)次數(shù)，循環(huán)次數(shù)增加使得樣品目的基因含量高的反應(yīng)管已進入平臺期，終產(chǎn)物量并不代表樣品目的基因含量；③PCR反應(yīng)的管間擴增效率差異總是存在的，既然PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，由擴增效率差異引起的產(chǎn)物擴增差異也呈指數(shù)積累，增加循環(huán)次數(shù)勢必增加終產(chǎn)物的差異，而減少循環(huán)次數(shù)又降低了檢測的靈敏度。傳統(tǒng)PCR對基因的檢測只能定性，不能定量主要是由擴增產(chǎn)物積累的動力學(xué)所決定的：①PCR產(chǎn)物在擴增過程中呈指數(shù)積累，當產(chǎn)物增加到一定程度，產(chǎn)物就停止了指數(shù)積累。我國PCR臨床應(yīng)用出現(xiàn)問題，產(chǎn)物污染所致假陽性是主要原因之一。FQPCR在全封閉狀態(tài)下實現(xiàn)PCR擴增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽性。擴增產(chǎn)物在開放狀態(tài)下分析，對實險室的污染是不可避免的。 標準曲線 2. 技術(shù)特點 封閉狀態(tài)下檢測，避免了擴增產(chǎn)物污染而致的假陽性 ④探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。②GC堿基含量在40%~60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。根據(jù)數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。當熒光信號增強到某一閾值（根據(jù)熒光信號基線的平均值和標準差，%的置信度大于平均值作為閾值）時，標準模板反應(yīng)管所用的循環(huán)次數(shù)（Ct值）就被記錄下來。通過實時檢測反應(yīng)管中的熒光信號，計算出RQ+、RQ、△RQ。 PCR反應(yīng)模式 （A）聚合反應(yīng)：（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物） 由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PRC產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，因此用熒光檢測技術(shù)檢測出的熒光信號有無或強弱，即代表擴增產(chǎn)物有無或多少。熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞，淬滅基團的淬滅作用被解除，熒光報告基團的熒光信號釋放出來（圖1）。當PCR反應(yīng)體系中有目的基因存在，就會擴增出特異核酸片段，熒光探針即會根據(jù)堿基配對的原理與之雜交。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標以熒光報告基團FAM（6羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518mm處），靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA(6羧基四甲基諾丹明,熒光發(fā)射峰值在582nm處)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。 熒光探針定量PCR（FQPCR）是一種新的基因定量檢測技術(shù)，國外文獻多用“實時定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美國PE公司商標命名) ”。熒光探針定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用 PCR技術(shù)是通過對基因的選擇性片段進行體外高效擴增，實現(xiàn)目的基因的檢測。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針，巧妙地把核酸擴增（PCR）、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，從而實現(xiàn)了對目的基因的準確定量檢測，正發(fā)展成為臨床實驗診斷的常規(guī)技術(shù)。FQPCR的工作原理[13]是利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標記的探針。當探針保持完整時，5’端熒光報告基團所激發(fā)出的熒光信號被3’端淬滅基因吸收或抑制，不出現(xiàn)熒光信號變化。當PCR進入延伸（復(fù)制）期，Tap酶從引物3’端開始,隨新鏈延伸沿DNA模板移動，當移動到探針結(jié)合的位置時，其5’→ 3’端外切酶活性作用，將探針切斷（切口平移效應(yīng)）。PCR反應(yīng)每復(fù)制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于熒光信號是代表擴增產(chǎn)物的有效特異信號，無需進行有效和無效信號分離，實現(xiàn)了儀器實時檢測(圖2)，為新的PCR定量原理創(chuàng)造了條件。ABI公司首先根據(jù)上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR儀，在PCR反應(yīng)中設(shè)置標準模板系列（一般5~7個標準濃度）反應(yīng)管和空白對照管。RQ+代表樣品管熒光報告基團發(fā)光強度與淬滅基團發(fā)光強度的比率，RQ代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ = RQ+RQ）代表PCR過程中熒光信號變化量。Ct值與標準模板數(shù)量的對數(shù)值之間有嚴格的線性關(guān)系[3]，利用系列標準模板的Ct值，制成標準曲線(圖3)，根據(jù)待測樣品的Ct值，就可在標準曲線中確定待測樣品起始的DNA數(shù)量。探針設(shè)計一般應(yīng)符合以下條件[2]：①探針長度應(yīng)在20~40個堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。傳統(tǒng)PCR于反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)液，通過電泳染色和紫外儀觀察結(jié)果。因污染而導(dǎo)致假陽性，成為PCR臨床實驗診斷技術(shù)應(yīng)用一個難以逾越的障礙。至于樣品間的污染，無論從目的基因的數(shù)量、濃度還是顆粒大小分析，都比較容易控制。 基因的定量檢測，擴展了臨床應(yīng)用空間不同起始模板，其指數(shù)增長期所用的循環(huán)是不同的，因此，不同數(shù)量基因的樣品在同一循環(huán)次數(shù)中積累的產(chǎn)物不能作為樣品基因定量的依據(jù)；②PCR產(chǎn)物積累到一定程度就不能再增加，再進入平臺期。FQPCR采用實時檢測，使所有含有不同數(shù)量的目的基因均在同一條件（達到熒光閾值）下進行分析，因而更具有可比性。 光譜技術(shù)進一步提高了靈敏度靈敏度提高得益于光譜技術(shù)。PCR 擴增中常會出現(xiàn)非特異性擴增和引物二聚體，從而影響了對特異電泳帶的判斷。 擴增與自動分析一體化，檢測更加簡便和快速3. 臨床應(yīng)用概要但對于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展來說，相關(guān)基因不是有無問題，而是一個從量變到質(zhì)變的過程，基因定量檢測更具有臨床意義。PCR在醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)中最有價值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對感染性疾病的診斷。一般實驗室也能檢出10~102基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要1057個病原體才可檢測到。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關(guān)；有也研究表明，HIV病毒載量低于一定值時，沒有傳染性。在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。 腫瘤 PCR技術(shù)不但能有效的檢測基因的突變，而且能準確檢測癌基因的表達量，可據(jù)此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。目前臨床對此多用免疫學(xué)方法檢測，靈敏度低，一般需要達到108個分子數(shù)。 遺傳病基因的突變和缺失均會引起各種珠蛋白的表達不平衡，用FQPCR檢測各種珠蛋白基因表達差異，是地中海貧血診斷的有效手段?？傊?，除與疾病直接相關(guān)的基因檢測外，各種與疾病相關(guān)的細胞因子、激素、受體，用FQPCR方法檢測其基因表達水平具有更高的靈敏性，更有利于疾病診斷。定量檢測與定性檢測的最大區(qū)別就在于，定性只是檢測病原體核酸的“有”或“無”，而定量可以檢測病原體核酸量的“多”或“少”。定量檢測的意義：1. 體現(xiàn)病原體含量與復(fù)制水平、感染程度之間的關(guān)系。 3. 用于傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預(yù)測與預(yù)防。 5. 建立新的病原體分子診斷標準。 二 熒光定量PCR報告結(jié)果的讀?。?報告為“copies/ml”、“2U/ml”或“copies”, copy即“拷貝”，表示病原體基因組的個數(shù)，該數(shù)據(jù)越大，表明病原體在體內(nèi)復(fù)制得越厲害，傳染性越強。例：HBVDNA 定量結(jié)果報告：104 IU/ml（如果采用科學(xué)記數(shù)法表示為：+04），代表每ml血液中含有36,370國際單位乙肝病毒分子。如果待檢標本能夠定量，如血液等，結(jié)果報告為多少copies/ml或2U/ml。如果待檢標本不易定量，如分泌物、痰液等，結(jié)果只報告為多少copies。HBV感染是全球性公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計。 HBV感染后臨床表現(xiàn)呈多樣性，可表現(xiàn)為重癥肝炎、急性肝炎、慢性肝炎或無癥狀攜帶者，其中部分慢性肝炎可演變成肝硬化或肝癌。 HBsAg大量存在于感染者血中，是HBV感染的主要標志，可刺激機體產(chǎn)生保護性抗體即HBsAb。HBcAg位于內(nèi)衣殼部分，其外被HBsAg所覆蓋，不易在血循環(huán)中檢出。HBcAb lgG在血中持續(xù)時間較長，為非保護性抗體。 HBeAg的消長與病毒體的DNA聚合酶的消長一致，故可作為HBV復(fù)制及強感染性的指標。 在這三對抗原、抗體系統(tǒng)中，核心抗原較難檢測到，一般不作為臨床常規(guī)檢查，故稱為“兩對半”。 二 “兩對半”檢測與HBVDNA定量 由于個體反應(yīng)的差異，不同的人在感染HBV后會出現(xiàn)不同的免疫應(yīng)答，從而得到不同的“兩對半”結(jié)果模式。但是所有這些免疫學(xué)指標不能反映患者或病人體內(nèi)病毒的復(fù)復(fù)水平及傳染程度，不能提示其與乙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展過程之間的聯(lián)系。熒光探針定量PCR技術(shù)則是從分子生物學(xué)水平直接檢測HBV病