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實(shí)時(shí)熒光定量pcr介紹-展示頁

2025-05-21 23:39本頁面

　　

【正文】擴(kuò)增曲線基線平整 Negative Control為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺區(qū)匯于一起線性范圍寬實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 26 5/27/2022 ? 理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（ r2）：大于，越接近 1，結(jié)果可信度越高。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 24 5/27/2022 ? 體外轉(zhuǎn)錄 RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 RNA純化后，測 OD定量。 cDNA 體外轉(zhuǎn)錄 RNA DNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品 RNA樣品定量標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 23 5/27/2022 ? 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程基因組 DNA PCR 目的基因克隆目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取， OD值定量。 No Template Control確認(rèn) 30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。 Real Time PCR用引物與普通 PCR引物設(shè)計(jì)要求不同 = 對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格普通 PCR引物 Real Time PCR引物實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 17 5/27/2022 ? 兩條引物的 Tm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計(jì)算 Tm值 ★ ★ ★ Tm值 4060%(最好 4555%) ★ GC含量 Primer長度 80150 bp(盡量限制在 300 bp以內(nèi) ) ★ 擴(kuò)增片段大小 ★ 1725 base 使用 BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 ★ ★ ★ 特異性 △ 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免 3 base以上的互補(bǔ)序列 △ 引物 3’ 末端避免 2 base以上的互補(bǔ)序列 ★ ★ ★ 互補(bǔ)性 3’ 末端序列 △ 整體上堿基不能過偏 △ 個(gè)別部分避免 GC rich或 AT rich(特別是 3’ 端 ) △ 避免 T/C連續(xù)， A/G連續(xù) ★ 序列 ★ △ 3’ 末端避免 GC rich或 AT rich △ 3’ 末端堿基最好為 G 或 C △ 3’ 末端堿基盡量避免為 T 盡量在 Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組 DNA擴(kuò)增 ★ ★ ★ RTPCR用引物 Real Time PCR引物設(shè)計(jì)原則實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 18 5/27/2022 ? 探針的 Tm比引物高 810℃ ★ ★ ★ Tm值 2024 bp ★ ★ Probe長度探針 5’ 末端的第一個(gè)堿基不能是 G ★ 5’ 末端序列 △ 目的序列 GC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計(jì) △ 整體上堿基不能過偏 △ 個(gè)別部分避免 GC rich或 AT rich (特別是 3’ 端 )；避免 T/C 連續(xù)， A/C連續(xù) ★ 序列 Probe內(nèi)部或 Probe與兩條引物之間避免 3 base以上的互補(bǔ)序列 ★ ★ ★ 互補(bǔ)性 BLAST檢索確認(rèn) Probe特異性 ★ ★ ★ 特異性 Real Time PCR用 TaqMan探針設(shè)計(jì)原則 Real Time PCR探針設(shè)計(jì)原則實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 19 5/27/2022 ? 線性關(guān)系、擴(kuò)增效率確認(rèn) 檢測靈敏度確認(rèn) PCR擴(kuò)增效率（ E）： 35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。 RT Primer的選擇實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 16 5/27/2022 ? Real Time PCR引物設(shè)計(jì) 目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。 Oligo dT Primer 5’ 3’ R F AAA 5’ 3’ 目的片段 R F 1,500 base Oligo dT Primer Random 目的片段 5’ 3’ R F 目的片段在 mRNA任何位置都能使用。 One Step RTPCR 只能使用 Gene Specific Primer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 9 5/27/2022 ? Primer 退火 F F F F SYBR Green I 法作用機(jī)理示意圖 Pol. F Primer Pol. 延伸 F F F F F F Primer 熱變性 F F F

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