【正文】 物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測(cè)方法 Real Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR檢測(cè)方法 ? 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) ? 熒光探針法 TaqMan probe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpions probe Amplifluor probe 生物秀 — 專心做生物！ SYBR Green I是一種結(jié)合于所有 dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。 生物品種鑒定 病毒和病原菌定量分析 導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析 GMO定量檢測(cè) SNP解析 激發(fā)光 發(fā)射光 Ct值 Real Time PCR 原理 使用 Real Time PCR擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法。 Real Time PCR 生物秀 — 專心做生物！ 同一個(gè)樣品重復(fù) 96次 PCR的擴(kuò)增曲線 Real Time PCR 原理 Ct值 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR擴(kuò)增過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) SYBR Green I 生物秀 — 專心做生物！ 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I)作用機(jī)理示意圖 熱變性 引物退火 延伸反應(yīng) 生物秀 — 專心做生物！ TaqMan探針為一寡核苷酸， 5’端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán) (Reporter)， 3’端標(biāo)記一個(gè)淬滅熒光基團(tuán) (Quencher)。 Probe法 ◆優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重 PCR。 ● Primer Dimer的產(chǎn)生 二條引物的 3’端具有互補(bǔ)序列時(shí)，引物自身也會(huì)進(jìn)行擴(kuò)增， 產(chǎn)生短鏈 DNA片段（ Primer Dimer）。 、 LightCycler174。 、 Mx3005PTM 杭州博日 LINEGENE FQD33A、 LINEGENE FQD66A Real Time PCR檢測(cè)系統(tǒng) 簡介 LightCycler174。 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ? One Step RTPCR和 Two Step RTPCR的選擇 ? RT Primer的選擇 ? Total RNA中 genomic DNA混入的對(duì)策 Real Time PCR反應(yīng) ? Real Time PCR引物及探針的設(shè)計(jì) ? 引物反應(yīng)性確認(rèn) ? PCR條件優(yōu)化順序 生物秀 — 專心做生物！ One Step RTPCR 和 Two Step RTPCR的選擇 Two Step RTPCR One Step RTPCR cDNA分裝 適用于 mRNA表達(dá)量解析 ? Two Step RTPCR效率高 ? 使用 Random和 OligodT 引物可以制備 cDNA pool ? cDNA可長期保存 適用于病毒、病原菌檢測(cè) ? 操作簡單 ? 污染幾率低 生物秀 — 專心做生物！ Random 6mer Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer RT Primer的選擇 Random 6mer Primer Gene specific Primer Oligo dT Primer 生物秀 — 專心做生物！ RT Primer的選擇 Random 6mer 1,500base 目的片段 5’ 3’ R F 目的片段在 mRNA任何位置都能使用。 5’ 3’ Gene specific Primer 目的片段 R F AAA 目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。 cDNA 體外轉(zhuǎn)錄 RNA PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒 生物秀 — 專心做生物！ 綠色 部分為 Real Time引物區(qū) 紅色 部分為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建用引物區(qū) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物設(shè)計(jì) 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 AGTACCTAGATCCTAG AGTACCTAGATCCTAG 生物秀 — 專心做生物！ 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 基因組 DNA PCR 目的基因克隆 質(zhì)粒提取， OD值定量。 體外轉(zhuǎn)錄 RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 T7 RNA polymerase 體外轉(zhuǎn)錄 RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT???T PCR產(chǎn)物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA???A AAAA???A 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 擴(kuò)增曲線 106 105 104 103 102 101 標(biāo)準(zhǔn)曲線 106 105 104 103 102 101 ? 標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇： 5～ 6個(gè)梯度 ? 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇： 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為 10 生物秀 — 專心做生物！ 理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線 相關(guān)系數(shù)（ r2）：大于 ，越接近 1，結(jié)果可信度越高。 生物秀 — 專心做生物！ 特異性產(chǎn)物 非特異產(chǎn)物 引物二聚體 對(duì) PCR產(chǎn)物特異性進(jìn)行分析 融解曲線分析 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 融解曲線分析 絕對(duì)定量和相對(duì)定量解析方法 Real Time PCR 解析方法 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 絕對(duì)定量解析方法 引物設(shè)計(jì) 標(biāo)準(zhǔn)品制備 Real Time PCR反應(yīng) 數(shù)據(jù)分析 流 程 生物秀 — 專心做生物！ 絕對(duì)定量解析方法 通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。 相對(duì)表達(dá)量計(jì)算 相對(duì)值 = 校正值 = 目的基因定量結(jié)果 管家基因定量結(jié)果 檢測(cè)樣品的校正值 對(duì)照樣品的校正值 相對(duì)定量解析順序 檢測(cè)樣品 管家基因 H 目的基因 X 定量結(jié)果 定量結(jié)果 校正值 相對(duì)量 RNA樣品 1 RNA樣品 2 RNA樣品 3 543210123相對(duì)表達(dá)量（Log2）R N A 樣品1 R N A 樣品2 R N A 樣品3R N A 樣品1R N A 樣品2R N A 樣品3生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 定性分析 對(duì)人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 絕對(duì)定量 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量分析 相對(duì)定量 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 定性分析應(yīng)用例 對(duì)人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 檢測(cè)方法 Cycling Probe法 SNP位點(diǎn) ALDH2 type1和 ALDH2 type2 (G/A) 使用試劑 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa 使用儀器 Smart Cycler Ⅱ 實(shí)驗(yàn)背景 Aldehyde dehydrogenase2（ ALDH2） 基因位于人類第 12對(duì)染色體 q24位置 ， 有 ALDH2 type1和 ALDH2 type2兩種基因型 ， 其基因表現(xiàn)序列最主要的差別在 exon12第 487個(gè)氨基酸位置 ，ALDH2 type1型為 Glu(GAA), ALDH2 type2型為 Lys(AAA)。 ExScriptTM RTPCR Kit（ Perfect Real Time） TaKaRa Code 儀 器 LineGene33 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 樣品處理 樣品數(shù) 目的基因 管家基因 藥物處理前 2 X GAPDH 藥物處理 3小時(shí) 2 藥物處理 6小時(shí) 2 藥物處理 9小時(shí) 2 藥物處理 12小時(shí) 2 樣 品 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ Total RNA提取 Total RNA基因組 DNA去除 標(biāo)準(zhǔn)品 RNA制備 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及預(yù)實(shí)驗(yàn) 詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)資料獲取 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及引物 設(shè)計(jì)、合成 樣品 Real Time PCR反應(yīng) 相對(duì)定量計(jì)算 及數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)整理及論文撰寫 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 提取 Total RNA去除基因組 DNA后電泳照片 對(duì)照組 3hr處理 6hr處理 9hr處理 12hr處理 RNA純度： 260/280 提取試劑： TaKaRa RNAiso Reagent TaKaRa Code D312 基因組 DNA去除試劑： DNase I(RNase Free) TaKaRa Code D2215 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 構(gòu)建 RNA標(biāo)準(zhǔn)品電泳照片 M GAPDH X基因 TaKaRa in Vitro Transcription T7 Kit (TaKaRa Code D6140) 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果 擴(kuò)增曲線圖 融解曲線圖 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 管家基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 樣品目的基因定量結(jié)果 擴(kuò)增曲線圖 融解曲線圖 樣品管家基因定量結(jié)果 相對(duì)定量應(yīng)用實(shí)例 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 目的基因 X 管家基因 H 已知量 Ct 定量結(jié)果 已知量 Ct 定量結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)品 1 10 1 標(biāo)準(zhǔn)品 2 100 10 標(biāo)準(zhǔn)品 3 1000 100 標(biāo)準(zhǔn)品 3 10000 1000 標(biāo)準(zhǔn)品 5 100000 10000 Sample1(空白） 353 41300 360 39500 Sample2(空白 ) 329 43800 305 41800 Sample3(3hr) 373 40900 393 38900 Sample4(3hr) 384 42700 396 43100 Sample5(6hr) 1670 44000 1600 45400 Sample6(6hr) 1570 38900 1570 38000 Sample7(9hr) 407 41600 328 40900 Sample8(9hr) 413 46700 419 43100 Sample9(12hr) 444 41600 474 41