rt-pcr（博士班實(shí)驗(yàn)課）(文件)
【正文】 時(shí)開始水解 ， 對(duì)于 ≤ 1kb的 RNA第一鏈合成溫度可以為 70℃ ， 對(duì)于＞ 1kb的 RNA則需要＜ 65℃ 。 C SuperScript?II RT 37176。因此，合成 cDNA的第 1條鏈時(shí)最好在相對(duì)較高的溫度下進(jìn)行。 增加 RTPCR靈敏度 ?分離高質(zhì)量 RNA ?使用無 RNaseH活性（ RNaseH）的逆轉(zhuǎn)錄酶 ?提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度 ?促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑 （ 甘油和 DMSO可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu) ） ?RNaseH處理 MMLV還是 AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源 RNaseH活性 。 (3) 不必使用 S1核酸酶來切割雙鏈 cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的 cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性 ,而是在 dNTP存在下 ,利用 RNA酶 H在雜交鏈的 mRNA鏈上造成 切口和缺口 。 (4) 適用于定量 PCR 但是由于單管反應(yīng)時(shí) RT 和 PCR 都不能在最佳條件下進(jìn)行并且容易相互干擾， 一步法反應(yīng)體系： 10 RTPCR Buffer 5μ l 模板 RNA 1μ l 正義引物 （ 10μ mol/L） 5μ l 反義引物 （ 10μ mol/L） 5μ l dNTP 5μ l RT/Taq Mix 1μ l DEPCH2O 28μ l 總體積 50μ l 一步法反應(yīng)步驟： 1循環(huán) 40℃ cDNA合成 1530min 94℃ 預(yù)變性 2min 3540循環(huán) 94℃ 變性 15s
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