【正文】 l Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 Real Time PCR 相關(guān)試劑與服務(wù) 主要內(nèi)容 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 定性分析 對(duì)人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 絕對(duì)定量 對(duì) SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量分析 相對(duì)定量 分析小鼠某目的基因藥物處理不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化 生物秀 — 專心做生物！ 定性分析應(yīng)用例 對(duì)人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 檢測(cè)方法 Cycling Probe法 SNP位點(diǎn) ALDH2 type1和 ALDH2 type2 (G/A) 使用試劑 Cycleave PCR Core Kit TaKaRa 使用儀器 Smart Cycler Ⅱ 實(shí)驗(yàn)背景 Aldehyde dehydrogenase2（ ALDH2） 基因位于人類(lèi)第 12對(duì)染色體 q24位置 ， 有 ALDH2 type1和 ALDH2 type2兩種基因型 ， 其基因表現(xiàn)序列最主要的差別在 exon12第 487個(gè)氨基酸位置 ，ALDH2 type1型為 Glu(GAA), ALDH2 type2型為 Lys(AAA)。 體外轉(zhuǎn)錄 RNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建流程 T7 RNA polymerase 體外轉(zhuǎn)錄 RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT???T PCR產(chǎn)物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA???A AAAA???A 生物秀 — 專心做生物！ 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 擴(kuò)增曲線 106 105 104 103 102 101 標(biāo)準(zhǔn)曲線 106 105 104 103 102 101 ? 標(biāo)準(zhǔn)品梯度的選擇： 5～ 6個(gè)梯度 ? 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)的選擇： 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)通常為 10 生物秀 — 專心做生物！ 理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線 相關(guān)系數(shù)（ r2）：大于 ，越接近 1，結(jié)果可信度越高。 目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) ? One Step RTPCR和 Two Step RTPCR的選擇 ? RT Primer的選擇 ? Total RNA中 genomic DNA混入的對(duì)策 Real Time PCR反應(yīng) ? Real Time PCR引物及探針的設(shè)計(jì) ? 引物反應(yīng)性確認(rèn) ? PCR條件優(yōu)化順序 生物秀 — 專心做生物！ One Step RTPCR 和 Two Step RTPCR的選擇 Two Step RTPCR One Step RTPCR cDNA分裝 適用于 mRNA表達(dá)量解析 ? Two Step RTPCR效率高 ? 使用 Random和 OligodT 引物可以制備 cDNA pool ? cDNA可長(zhǎng)期保存 適用于病毒、病原菌檢測(cè) ? 操作簡(jiǎn)單 ? 污染幾率低 生物秀 — 專心做生物！ Random 6mer Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer RT Primer的選擇 Random 6mer Primer Gene specific Primer Oligo dT Primer 生物秀 — 專心做生物！ RT Primer的選擇 Random 6mer 1,500base 目的片段 5’ 3’ R F 目的片段在 mRNA任何位置都能使用。 、 LightCycler174。 Probe法 ◆優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，能進(jìn)行多重 PCR。 Real Time PCR 生物秀 — 專心做生物！ 同一個(gè)樣品重復(fù) 96次 PCR的擴(kuò)增曲線 Real Time PCR 原理 Ct值 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR擴(kuò)增過(guò)程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識(shí) Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測(cè)方法 Real Time PCR 檢測(cè)系統(tǒng) 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR檢測(cè)方法 ? 熒光染料嵌合法 (SYBR Green I) ? 熒光探針?lè)? TaqMan probe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpions probe Amplifluor probe 生物秀 — 專心做生物！ SYBR Green I是一種結(jié)合于所有 dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。 但是 ??? 使用 SYBR Green I 進(jìn)行檢測(cè)的問(wèn)題點(diǎn) ● SYBR Green I與雙鏈 DNA進(jìn)行結(jié)合后散収熒光，因此如果反 應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增，非特異性 DNA也將同時(shí)被檢測(cè)， 從而可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。、 Mx3000P174。 One Step RTPCR只能使用Gene specific Primer， 不適用于 mRNA表達(dá)量分析等復(fù)數(shù)基因的檢出。 序列可信度高，信息量大 NCBI: The National Center for Biotechnology Information NM_008777 RefSeq 評(píng)價(jià) Pah Pah Pah Pah X51942 BC013458 BI330290 BF789560 X51942 BC013458 BI330290 BF789560 Pah Pah GenBank Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ NCBI提供目的基因相關(guān)信息 （ 基因名 、 染色體上的位置 、 Accession、表 現(xiàn) 型、 文獻(xiàn)索引 、 同源性等其他數(shù)據(jù)庫(kù)以及功能 、 pass way、 蛋白質(zhì)圖譜等 ） 基因詞典 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15APR2022 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_008777 VERSION GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1..1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48..1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding [goid 0005506] /protein_id= /db_xref=GI:6679203 /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381